張文軍 楊洪穎 申策 李茂恒 鄭宏江 左燕紅

胃癌在轉(zhuǎn)移進(jìn)展過程中將出現(xiàn)異質(zhì)性(Heterogeneity)變化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥性等與原發(fā)灶不同［1－3］。了解胃癌轉(zhuǎn)移組織中腫瘤細(xì)胞的特征對(duì)探討胃癌侵襲轉(zhuǎn)移規(guī)律有重要意義，但目前有關(guān)胃癌轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移情況的報(bào)道還很少見。埃茲(Ezrin)基因是新近發(fā)現(xiàn)的與多種惡性腫瘤關(guān)系密切的新基因，可促進(jìn)多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［4，5］。因此，本研究檢測(cè)了Ezrin蛋白在胃癌及區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)情況，并對(duì)其意義進(jìn)行了分析。為了解Ezrin蛋白在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，本研究同時(shí)檢測(cè)了細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)p65、細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)在原發(fā)腫瘤和區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)，并對(duì)三者間的關(guān)系進(jìn)行了分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析選擇2006年10月至2009年10月在我科手術(shù)并有術(shù)后病理證實(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的胃癌石蠟標(biāo)本36例，其中男25例，女11例;年齡38～75歲，平均年齡(60±10)歲。所有病例術(shù)前均未接受任何治療。每例患者的胃癌組織、相應(yīng)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)標(biāo)本均經(jīng)HE染色病理確診。兔抗人Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1多克隆抗體均購自美國(guó) Santa Cruz公司，免疫組化試劑盒購自福建邁新生物技術(shù)公司，

1.2 免疫組化染色測(cè)定 Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1蛋白表達(dá)

石蠟包埋標(biāo)本4 μm連續(xù)切片后進(jìn)行HE和免疫組化染色。切片脫蠟水化，3%過氧化氫孵育、蒸餾水沖洗，以磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡后進(jìn)行抗原修復(fù)。以下嚴(yán)格按試劑盒說明操作:工作液封閉、加入一抗、孵育并沖洗后依次加二抗工作液、辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液。二氨基胺苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹脂封片。

1.3 結(jié)果判斷 染色結(jié)果由兩位病理學(xué)醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片判斷結(jié)果。每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野(×400)，每視野均計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞的陽性率。Ezrin、ICAM-1主要表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)，以出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為染色陽性;NF-κBp65以細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為染色陽性。Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1的記分標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞內(nèi)無陽性表達(dá)為(－)，＜50%細(xì)胞陽性表達(dá)為(+)，≥50%細(xì)胞陽性表達(dá)為(++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)灶中Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1表達(dá)情況 Ezrin、NF-κBp65在區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表均強(qiáng)于胃癌原發(fā)灶(P＜0.05)，在兩種組織間ICAM-1表達(dá)強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Ezrin、NF-κBp65 在胃癌原發(fā)灶、區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)間表達(dá)呈正相關(guān)性(P＜0.05)，而ICAM-1在兩種組織中表達(dá)無相關(guān)性(P＞0.05)。見表1。

表1 Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1在胃癌和區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達(dá) 例

2.2 胃癌原發(fā)灶及區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1三種蛋白質(zhì)的相關(guān)關(guān)系 胃癌組織中Ezrin與NF-κBp65表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.3894，P＜ 0.05)，NF-κBp65 與ICAM-1表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.3649，P＜0.05);Ezrin與ICAM-1表達(dá)無明顯相關(guān)關(guān)系(r=0.2867，P＞0.05);在區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中各因子間無明顯相關(guān)關(guān)系(r值分別為0.3022，0.2756，0.2928，P＞0.05)。

3 討論

Ezrin蛋白是ERM蛋白家族成員之一，在細(xì)胞的生長(zhǎng)過程中發(fā)揮重要作用，并且具有調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、黏附狀態(tài)等功能［6］。近年發(fā)現(xiàn)，Ezrin蛋白在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤中存在過表達(dá)，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［4，5，7］。胃癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，大多數(shù)就診的胃癌患者處于進(jìn)展期，存在轉(zhuǎn)移灶。隨著胃癌診治技術(shù)的進(jìn)步，目前臨床上對(duì)于轉(zhuǎn)移灶的治療已成為研究熱點(diǎn)，如能有效抑制轉(zhuǎn)移灶將大大提高胃癌綜合治療效果、改善預(yù)后。由于胃癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中許多分子都發(fā)生了變化，因此，分析轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)腫瘤間的分子差異對(duì)了解胃癌轉(zhuǎn)移規(guī)律、尋找治療靶位有重要意義。故本研究對(duì)Ezrin等蛋白質(zhì)在胃癌原發(fā)灶、區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)腫瘤比較，Ezrin蛋白在胃癌區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的表達(dá)更強(qiáng)，說明該蛋白在胃癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生了變化，這種變化導(dǎo)致轉(zhuǎn)移灶中的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力。本結(jié)果還顯示，在兩種組織中Ezrin蛋白表達(dá)具有相關(guān)性，這提示胃癌轉(zhuǎn)移過程中Ezrin蛋白的變化有一定規(guī)律，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

為進(jìn)一步了解造成Ezrin蛋白在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)變化的機(jī)制，我們進(jìn)一步檢測(cè)了NF-κBp65、ICAM-1的表達(dá)情況。NF-кB是一種核轉(zhuǎn)錄蛋白，在體內(nèi)多種組織中均有存在，且在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，該蛋白可通過對(duì)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，推進(jìn)細(xì)胞周期演進(jìn)并抑制凋亡，在細(xì)胞癌變過程中發(fā)揮重要作用［8］。Gavert等［9］的研究顯示，NF-кB 通路激活可促進(jìn) Ezrin蛋白表達(dá)，在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。因此，本研究對(duì)NF-кB家族中作用明確的NF-κBp65蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，NF-κBp65蛋白在胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)強(qiáng)于原發(fā)腫瘤，說明該蛋白在轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生了變化。結(jié)果還顯示，原發(fā)腫瘤中Ezrin蛋白和NF-κBp65蛋白存在相關(guān)關(guān)系，提示二者存在調(diào)控關(guān)系;但在區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中并未發(fā)現(xiàn)二者有關(guān)，我們推測(cè)這是由于胃癌轉(zhuǎn)移是極其復(fù)雜的過程，多種蛋白質(zhì)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與其中，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中Ezrin蛋白和NF-κBp65蛋白關(guān)系并不明顯。另外，本研究還檢測(cè)了ICAM-1的表達(dá)情況。ICAM-1在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，可以促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移進(jìn)展;也有研究顯示［10］，ICAM-1表達(dá)與Ezrin蛋白有關(guān)。本結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)在原發(fā)腫瘤中二者存在一定關(guān)系，但轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中并未發(fā)現(xiàn)二者有關(guān)。我們同樣認(rèn)為這是由于胃癌轉(zhuǎn)移過程的復(fù)雜性造成的。

由于胃癌轉(zhuǎn)移是多種機(jī)制、多種轉(zhuǎn)移相關(guān)因子相互間共同作用的結(jié)果，Ezrin、NF-κBp65、ICAM-1僅是其中部分因素。因此，評(píng)價(jià)Ezrin蛋白與腫瘤胃癌轉(zhuǎn)移關(guān)系時(shí)必須考慮其他相關(guān)因素的影響?？傊?，本研究證實(shí)Ezrin蛋白與胃癌轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，深入探討其作用對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移機(jī)制研究有重要意義。

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