金潔 樊明文 李宇紅

（1.杭州口腔醫(yī)院 牙體牙髓病科，杭州310006；2.口腔生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)，武漢430079）

變異鏈球菌是齲病的主要致病菌，其表面蛋白（Streptococcus mutans surface protein，PAc）參與介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)牙面的黏附[1]。研究[2]表明：攜帶PAc主要免疫活性區(qū)A-P片段的DNA防齲疫苗pCIA-P可有效誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的特異性免疫應(yīng)答。目前的研究[3-4]認(rèn)為：以DNA疫苗pCIA-P進(jìn)行初次免疫，再用蛋白質(zhì)疫苗PAc加強(qiáng)的策略可在較大程度上提高防齲疫苗的免疫效力。在“DNA初次免疫—蛋白質(zhì)加強(qiáng)”免疫策略的研究中，大量高純度的PAc的獲取是整個(gè)研究的基礎(chǔ)。由于變異鏈球菌表面蛋白的天然產(chǎn)量低，提取步驟煩瑣，難以滿(mǎn)足需要[5]，所以用基因工程的方法大量生產(chǎn)無(wú)疑是最佳選擇。筆者對(duì)已成功表達(dá)重組PAc（recombinant PAc，rPAc）的工程菌pET20b（+）-AP/BL21（DE3）plysS的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，并用純化后的rPAc蛋白免疫BALB/c小鼠，制備抗rPAc多克隆抗體，為深入研究“DNA初次免疫—蛋白質(zhì)加強(qiáng)”免疫策略奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 rPAc表達(dá)條件的優(yōu)化

在pH值分別為6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4的Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基（含100 μg·mL-1羧芐青霉素和34 μg·mL-1氯霉素）上接種pET20b（+）-AP/BL21（DE3）plysS工程菌[4]，37 ℃條件下培養(yǎng)，檢測(cè)光密度（optical density，OD）值達(dá)0.6（檢測(cè)波長(zhǎng)600 nm）時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol·L-1的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thigalactopyranoside，IPTG），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，同時(shí)設(shè)定工程菌的未誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)照組。培養(yǎng)結(jié)束后，4 ℃離心收集菌體，冰浴下超聲波破碎，離心后取上清液，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析培養(yǎng)基pH值對(duì)rPAc可溶性表達(dá)的影響，確定培養(yǎng)基的最佳pH值。固定其他條件，按照與上述研究類(lèi)似的方法，分別設(shè)置IPTG濃度梯度（0.1、0.4、0.8、1.0、2.0 mmol·L-1）、時(shí)間梯度（1、2、3、4、5 h）、溫度梯度（18、24、28、30、37 ℃）、菌體密度梯度（OD600nm分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0）。SDS-PAGE檢測(cè)rPAc可溶性表達(dá)的結(jié)果，凝膠成像分析系統(tǒng)（UVP公司，美國(guó)）掃描電泳圖片，進(jìn)行半定量分析，確定最優(yōu)表達(dá)條件。

1.2 rPAc的純化和鑒定

pET20b（+）-AP/BL21（DE3）plysS工程菌根據(jù)上述優(yōu)化條件進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)束后集菌，超聲波破碎，離心取上清液，經(jīng)0.45 μm濾器過(guò)濾，上樣于Ni2+-NTA層析柱純化（按荷蘭Qiagen公司提供的Ni2+-NTA使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行），SDS-PAGE分析純化結(jié)果。UVP凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白純度。rPAc純化產(chǎn)物的Western blot鑒定參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[6]進(jìn)行，一抗為抗His-tag單克隆抗體，二抗為辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG。將鑒定正確的rPAc純化產(chǎn)物轉(zhuǎn)入超濾管中進(jìn)行濃縮及除鹽，以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用Bradford法定量后冷凍干燥，分裝保存。

1.3 抗rPAc多克隆抗體的制備與鑒定

用約50 μg rPAc蛋白免疫BALB/c小鼠，免疫周期為0、14、28、42 d。第1次用弗氏完全佐劑，其余3次用弗氏不完全佐劑。第4次免疫1周后摘取眼球取血，離心分離血清，分裝后-80 ℃凍存?zhèn)溆谩⒓兓膔PAc交聯(lián)至Sepharose 4B（Pharmacia Biotech公司，美國(guó)），其操作步驟參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明。然后將多抗血清用PBS稀釋后與交聯(lián)rPAc介質(zhì)進(jìn)行孵育，再用PBS洗脫未結(jié)合的蛋白，用甘氨酸-鹽酸緩沖液（pH為2.7）洗脫結(jié)合的抗體，并用Tris-HCl緩沖液（pH為9.0）將洗脫液中和至pH為7.3左右。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法測(cè)定抗體效價(jià)。將純化后的rPAc行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，分別用純化rPAc的多抗血清或抗His-tag單克隆抗體作為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行Western blot分析，方法同1.2。以免疫前的小鼠血清為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 rPAc表達(dá)條件的優(yōu)化

利用SDS-PAGE分析不同誘導(dǎo)表達(dá)條件下細(xì)菌裂解上清液中可溶性rPAc蛋白含量的變化，結(jié)果顯示：隨著IPTG濃度的增加，rPAc可溶性表達(dá)量逐漸加大，當(dāng)IPTG濃度達(dá)1.0 mmol·L-1時(shí)達(dá)到峰值，此后不再明顯升高（圖1）。隨著誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、菌體密度及培養(yǎng)基pH值的增加，可溶性rPAc表達(dá)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，分別在誘導(dǎo)溫度30 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間4 h、菌體密度OD600nm=0.6、pH=7.2時(shí)，rPAc的可溶性表達(dá)量達(dá)到最大（圖2～5）。

圖1 rPAc在不同IPTG濃度下的可溶性表達(dá)相對(duì)含量分析Fig 1 The soluble expression of rPAc under different concentrations of IPTG

圖2 rPAc在不同誘導(dǎo)溫度下的可溶性表達(dá)相對(duì)含量分析Fig 2 The soluble expression of rPAc under different inducing temperature

圖3 rPAc在不同誘導(dǎo)時(shí)間下的可溶性表達(dá)相對(duì)含量分析Fig 3 The soluble expression of rPAc under different inducing time

圖4 rPAc在不同菌體密度下的可溶性表達(dá)相對(duì)含量分析Fig 4 The soluble expression of rPAc under different growth density

圖5 rPAc在不同培養(yǎng)基pH值下的可溶性表達(dá)相對(duì)含量分析Fig 5 The soluble expression of rPAc under different medium pH

2.2 rPAc的純化和鑒定

SDS-PAGE分析顯示：純化后的rPAc在相對(duì)分子質(zhì)量為8.5×104處呈單一條帶（圖6），和預(yù)期大小相符。經(jīng)UVP凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析，其純度約為95%。采用Bradford法測(cè)定純化蛋白的質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1。Western blot結(jié)果顯示：純化后的rPAc在相對(duì)分子質(zhì)量為8.5×104處出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)條帶，條帶清晰，無(wú)其他雜帶出現(xiàn)，特異性良好（圖7）。對(duì)照組無(wú)反應(yīng)條帶出現(xiàn)。

2.3 抗rPAc多克隆抗體的制備與鑒定

免疫小鼠的多抗血清經(jīng)ELISA分析，抗體效價(jià)為1∶6 000。Western blot分析結(jié)果見(jiàn)圖8?？箁PAc多克隆抗體和抗His-tag單克隆抗體在相對(duì)分子質(zhì)量8.5×104大小處均出現(xiàn)特異性的單一陽(yáng)性條帶，無(wú)其他可見(jiàn)雜帶出現(xiàn)；陰性對(duì)照無(wú)任何特異性反應(yīng)條帶：說(shuō)明免疫小鼠的血清經(jīng)純化后制備的多克隆抗體可以與rPAc純蛋白結(jié)合并且特異性較好。

圖6 rPAc純化的SDS-PAGE分析Fig 6 The purified rPAc identification by SDS-PAGE

圖7 rPAc純化的Western blot分析Fig 7 The purified rPAc identification by Western blot

圖8 抗rPAc多克隆抗體的Western blot分析結(jié)果Fig 8 Western blot results of the anti-rPAc polyclonal antibody

3 討論

為了獲取大量高純度PAc，最大限度地提高rPAc可溶性表達(dá)量已經(jīng)成為關(guān)注的重點(diǎn)?？扇苄员磉_(dá)的優(yōu)點(diǎn)為純化步驟簡(jiǎn)單，蛋白獲得率較高，對(duì)蛋白活性影響小。對(duì)本研究來(lái)講，能否僅通過(guò)優(yōu)化各種已知的影響原核表達(dá)系統(tǒng)的相關(guān)因素來(lái)有效解決這一難題是首先應(yīng)該采取的必要措施。為此，本研究針對(duì)影響rPAc可溶性表達(dá)的各種因素進(jìn)行了較為系統(tǒng)的探索[7]。

溫度是影響目的蛋白在大腸桿菌中獲得高水平可溶性表達(dá)的重要因素。適合大腸桿菌生長(zhǎng)的溫度為37～39 ℃，在此溫度下表達(dá)外源蛋白極易生成包涵體。較低的生長(zhǎng)溫度能降低蛋白質(zhì)合成的速率，使新合成的蛋白質(zhì)有更充分的時(shí)間折疊，減少蛋白折疊中間體之間錯(cuò)誤的相互作用，使得正確折疊的蛋白增加，有效地增加可溶性蛋白的表達(dá)量[8]；但培養(yǎng)溫度也有一個(gè)下限，一般為8～10 ℃，在此溫度以下，大腸桿菌將停止生長(zhǎng)，蛋白也基本停止表達(dá)[9]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)：在18～37 ℃溫度梯度下，誘導(dǎo)溫度為30 ℃時(shí)，rPAc可溶性表達(dá)量達(dá)到最大。IPTG是一種有效的乳糖操縱子誘導(dǎo)劑，可競(jìng)爭(zhēng)性地與阻遏蛋白結(jié)合，開(kāi)放目標(biāo)蛋白基因，使其得以轉(zhuǎn)錄[10]。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果顯示：隨著IPTG濃度的升高，rPAc可溶性表達(dá)量逐漸增加，但當(dāng)IPTG濃度在1.0 mmol·L-1以上時(shí)，rPAc可溶性表達(dá)量不再發(fā)生明顯改變。這是因?yàn)楫?dāng)加入的IPTG量足以封閉所有阻遏蛋白位點(diǎn)時(shí)，其濃度即為理論上的最佳濃度。IPTG濃度過(guò)高可能會(huì)影響到細(xì)菌的生長(zhǎng)，過(guò)低會(huì)因?yàn)闈舛冗_(dá)不到與阻遏蛋白結(jié)合的飽和濃度而影響目標(biāo)蛋白的表達(dá)。故以1.0 mmol·L-1為最佳IPTG濃度，該濃度不僅可以提高可溶性rPAc的表達(dá)量，而且可以降低成本。

菌體生長(zhǎng)過(guò)度或過(guò)速都會(huì)加重工程菌合成系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致形成包涵體。本實(shí)驗(yàn)的目的是蛋白的可溶性表達(dá)，故在實(shí)驗(yàn)中考察誘導(dǎo)前細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)間和誘導(dǎo)后細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)間對(duì)融合蛋白表達(dá)的影響。誘導(dǎo)后細(xì)菌的生長(zhǎng)時(shí)間隨不同的表達(dá)載體或啟動(dòng)子而不同。對(duì)T7、Ptac和Plac等啟動(dòng)子，一般僅需2～3 h。本實(shí)驗(yàn)采用的表達(dá)載體是含有T7啟動(dòng)子的pET表達(dá)載體。誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)短會(huì)影響rPAc的積累量；誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可溶性rPAc積累量超過(guò)一定限度，細(xì)菌為了保護(hù)自身，減少外源蛋白對(duì)其自身的毒性，從而啟動(dòng)包涵體的形成機(jī)制，可溶性rPAc表達(dá)量隨之減少[11]。在本實(shí)驗(yàn)1～5 h的時(shí)間梯度中，IPTG誘導(dǎo)rPAc可溶性表達(dá)的最佳時(shí)間為4 h。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)：在IPTG誘導(dǎo)前，菌體密度的OD600nm對(duì)后續(xù)rPAc可溶性表達(dá)量也有很大影響。大腸桿菌在OD600nm=0.6時(shí)，基本進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體生長(zhǎng)旺盛，增殖快；對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)而言，此時(shí)易于誘導(dǎo)合成外源蛋白。此外，IPTG的加入以及表達(dá)產(chǎn)物的增加對(duì)菌體生長(zhǎng)是有影響的，所以應(yīng)選在生長(zhǎng)最旺盛的時(shí)期進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。提前誘導(dǎo)菌體太少，外源蛋白產(chǎn)量低；而誘導(dǎo)太遲則細(xì)菌過(guò)老，也不利于基因表達(dá)。因此在本實(shí)驗(yàn)菌體密度OD600nm為0.2～1.0的梯度范圍內(nèi)，OD600nm=0.6時(shí)誘導(dǎo)獲得可溶性蛋白量最多。

培養(yǎng)基pH值對(duì)提高大腸桿菌中重組蛋白可溶性表達(dá)有明顯影響，需要根據(jù)菌體和重組蛋白的特點(diǎn)選擇合適的pH值。一般來(lái)說(shuō)，pH值距重組蛋白等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，表達(dá)的蛋白產(chǎn)物就越不容易形成包涵體（rPAc的等電點(diǎn)約是5.55）。李會(huì)成等[12]發(fā)現(xiàn)：所用工程菌的細(xì)胞生長(zhǎng)期的最適pH值為6.8～7.4，基因表達(dá)的最適pH值為6.0～6.5。據(jù)此本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基pH值的選擇范圍為6.4～7.4，結(jié)果表明：當(dāng)pH值為7.2時(shí)rPAc可溶性表達(dá)量最高。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以確定rPAc可溶性表達(dá)的最佳條件為：pH=7.2的LB培養(yǎng)基、細(xì)菌起始密度OD600nm=0.6時(shí)，用1.0 mmol·L-1的IPTG 30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。本實(shí)驗(yàn)不僅篩選出rPAc的最佳表達(dá)條件，而且每一項(xiàng)因素均設(shè)置了多個(gè)變化點(diǎn)，繪制了rPAc表達(dá)量隨不同誘導(dǎo)條件變化的曲線(xiàn)，這樣在實(shí)際表達(dá)過(guò)程中，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)性原則選擇最佳的表達(dá)條件。雖然本文對(duì)影響rPAc可溶性表達(dá)因素的單因子作了大量的工作，但rPAc可溶性表達(dá)的工藝比較復(fù)雜，僅僅對(duì)溫度、pH值等影響因素單獨(dú)地加以考慮是不夠的，因?yàn)楦鞣N因素之間有協(xié)同和（或）抵消作用，需要對(duì)它們進(jìn)行綜合考慮。下一步還需要應(yīng)用能夠綜合反映各種因素水平間交互作用的正交設(shè)計(jì)等方法，進(jìn)一步優(yōu)化可溶性蛋白制備的工藝處方。

目前聯(lián)合免疫策略增強(qiáng)防齲DNA疫苗免疫效應(yīng)的機(jī)制并不明確，有待于進(jìn)一步研究以促進(jìn)防齲疫苗的發(fā)展。為了研究聯(lián)合免疫策略以何種方式來(lái)增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效應(yīng)，筆者需要觀(guān)察目的抗原基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位及遞呈作用過(guò)程，這些研究工作都需要高效價(jià)、高特異性的抗體。為了滿(mǎn)足這一需求，筆者以純化的rPAc免疫小鼠后，經(jīng)親和層析獲得理想的抗rPAc抗體。Western bolt分析顯示本實(shí)驗(yàn)所制備的抗體雖然是多克隆抗體，但是仍有很高的特異性，可以為今后深入探索“DNA初次免疫—蛋白質(zhì)加強(qiáng)”免疫機(jī)制提供必要的工具。

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