武曦 黃鏡靜 張綱 譚穎徽 高鈺琪

（1.第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院 口腔科；2.第三軍醫(yī)大學高原軍事醫(yī)學系，重慶400037）

氧自由基是機體代謝中的產物，生理情況下，其產生和清除保持動態(tài)平衡，不會對機體產生損傷。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是機體對抗氧自由基的第一道防線，其活性直接影響機體內氧自由基的清除。

研究[1-2]表明：在一定程度上牙周炎是自由基產生和清除失衡介導的組織損傷，牙周炎癥時，中性粒細胞通過呼吸暴發(fā)釋放過多的氧自由基，對周圍組織細胞產生破壞。高原低氧環(huán)境會增加機體的氧化壓力，改變組織細胞的代謝，從而造成各種生理病理反應。流行病學調查[3]顯示高原地區(qū)牙周患病率顯著高于其他地區(qū)，且炎癥程度明顯加重，但其具體機制尚不明確。本研究通過建立兔高原牙周炎模型，觀察其血清和牙齦組織中SOD活力水平的改變，以探討SOD和氧自由基在高原牙周病發(fā)病機制中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料和儀器

中國大白兔（第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院實驗動物中心提供），速眠新Ⅱ（獸用注射麻藥，吉林省華牧動物保健品有限公司），牙菌斑顯示片（上海益口佳口腔護理用品有限公司），BCA試劑、SOD活力測試盒（南京建成生物工程研究所），Infinite M200多功能酶標儀（Tecan公司，澳大利亞），DU-800核酸蛋白檢測儀（Beckman公司，美國），低壓動物艙（第三軍醫(yī)大學高原軍事醫(yī)學系）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及飼養(yǎng) 健康雄性白兔40只，體重（1.9±0.2）kg，隨機分為4組，每組10只。其中，常氧對照組為普通飲食常氧常規(guī)飼養(yǎng)；常氧實驗組建立牙周炎動物模型，常氧常規(guī)飼養(yǎng)；低氧對照組為普通飲食低壓氧艙飼養(yǎng)；低氧實驗組建立牙周炎動物模型，低壓氧艙飼養(yǎng)。低氧實驗組和對照組動物每天進入模擬海拔5 000 m環(huán)境的低壓氧艙23 h。

1.2.2 牙周炎動物模型的建立方法 將常氧實驗組和低氧實驗組動物用速眠新（0.1～0.2 mL·kg-1）經肌肉注射麻醉，采用口腔正畸結扎絲（直徑0.25 mm）結扎雙下頜中切牙牙頸部一圈，結扎絲盡量靠近齦緣，以不損傷牙齦上皮為宜。定期對動物口腔內狀況復查，脫落或移位結扎絲重新結扎。按照Keyes’s diet 2000牙周炎食譜[4]喂養(yǎng)。

1.2.3 動物體重檢測 在實驗初始、2、4、6、8周清晨空腹時分別稱取動物體重，按編號記錄。

1.2.4 血清和牙齦組織樣本采集 在實驗第8周時，取動物清晨空腹耳緣靜脈血標本，4 ℃下靜置過夜，3 000 r·min-1、4 ℃低溫離心15 min取上層血清，分裝至無菌EP管中，登記編號，-70 ℃保存?zhèn)溆?。取各組動物下頜中切牙周圍牙齦組織，4 ℃冰生理鹽水漂洗去除血液后，濾紙吸干，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 牙周各項臨床指標檢測 實驗8周后，檢查各組動物下頜中切牙的牙周情況。1）牙齦指數(shù)（gingival index，GI）：用牙周探針檢測雙下頜中切牙，輕探至齦溝或牙周袋底，移出探針后停留1～2 s，觀察牙齦出血情況。2）牙菌斑指數(shù)（plaque index，PLI）：用棉簽蘸取少量菌斑顯示液，輕輕地均勻涂于雙下頜中切牙牙面、齦緣及鄰間隙處，待1～2 min后觀察顯色情況，采用Loe和Slliness四分度計分標準進行計分。3）附著喪失（attachment loss，AL）：探診記錄牙周袋深度后，探針沿牙面退出探尋釉牙骨質界，記錄釉牙骨質界到齦緣的距離，探診深度減去該距離即為附著喪失，每牙測近中、正中、遠中3個位點，兩側牙共6個位點取均值。操作均由同一人完成。

1.2.6 血清和牙齦組織中總SOD（total-SOD，T-SOD）活力測定 血清：將血清復溫至室溫。牙齦組織：組織塊稱重后，冰浴速剪置入組織勻漿器中，加入適量冰生理鹽水，按組織塊重量∶鹽水體積為1∶9制備10%組織勻漿，3 000 r·min-1、4 ℃低溫離心15 min取上清，再用生理鹽水按體積比1∶9稀釋成1%的組織勻漿樣本，BCA法測定1%組織勻漿樣本中總蛋白含量，再按T-SOD活力測試盒說明書對上述血清和組織勻漿標本進行測定，使各組T-SOD抑制率為0.15～0.55，計算各個樣本中T-SOD的活力。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。等級資料GI、PLI采用秩和檢驗，計量資料AL、T-SOD活力以±s表示，組間比較采用方差分析，低氧實驗組AL、血清及牙齦組織中T-SOD活力的相關性采用Spearman相關分析。

2 結果

2.1 體重的動態(tài)變化

各組兔體重的動態(tài)變化見表1。從表1可見，各組動物體重在實驗初始時無明顯差異，隨著時間延長，低氧組動物較常氧組動物體重增長緩慢。8周時常氧實驗組和低氧實驗組體重較相應對照組增長速度快，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；低氧實驗組與常氧實驗組、低氧對照組與常氧對照組相比，體重也有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。

表1 各組兔體重的動態(tài)變化Tab 1 The dynamic change of weights in every group kg

2.2 牙周臨床指標

實驗8周時，常氧對照組牙周組織肉眼觀察無明顯變化，多數(shù)僅在齦緣區(qū)有少量菌斑，用探針可刮出；常氧實驗組牙周組織有中度炎癥，牙齦紅腫光亮，可探及牙周袋，探診出血（+），多數(shù)齦緣或牙面可見中等量菌斑；低氧對照組牙周組織有輕度炎癥，牙齦輕度水腫，探診不出血，多數(shù)齦緣或牙面可見少量菌斑；低氧實驗組牙周組織有嚴重炎癥，牙齦明顯紅腫退縮，可探及較深牙周袋，探診出血（+），有自發(fā)出血傾向，在齦緣和牙面可見大量食糜。

各組的PLI、GI結果見表2。統(tǒng)計分析表明：低氧實驗組的PLI、GI與低氧對照組和常氧實驗組相比，有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；常氧實驗組與常氧對照組、低氧對照組與低氧實驗組相比，均有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。

表2 各組的PLI、 GI結果Tab 2 The results of PLI and GI in every group

常氧對照組、常氧實驗組、低氧對照組、低氧實驗組的AL分別為（0.36±0.11）、（2.57±0.23）、（1.30±0.15）、（3.81±0.29）mm。統(tǒng)計分析表明：常氧實驗組、低氧對照組的AL與常氧對照組相比，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；低氧實驗組的AL與常氧實驗組、低氧對照組相比，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

2.3 T-SOD活力

各組血清和牙齦組織中T-SOD活力的比較見表3。從表3可見，低氧實驗組T-SOD活力較常氧實驗組、低氧對照組顯著降低，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；常氧實驗組與常氧對照組比較，T-SOD活力也降低，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

表3 各組血清和牙齦組織中T-SOD活力的比較Tab 3 Comparison of T-SOD activity in serum and gingival tissues in every group

2.4 低氧實驗組AL、血清及牙齦組織中T-SOD活力的相關性

低氧實驗組AL、血清及牙齦組織中T-SOD 活力的相關性見表4。由表4可見：血清及牙齦組織中TSOD活力與AL呈負相關（r值分別為-0.980和-0.804，P＜0.01），血清與牙齦組織中T-SOD活力呈正相關（r=0.846，P＜0.01）。這表明，模擬高原條件下牙周炎模型中全身和局部的T-SOD活力均隨附著喪失的增加顯著降低，全身與局部的改變一致。

表4 低氧實驗組AL、 血清及牙齦組織中T-SOD活力的相關系數(shù)Tab 4 Coefficient correlation among AL and activity of T-SOD in serum and gingival tissues in hypoxia periodontitis group

3 討論

高原特殊環(huán)境下，機體難以耐受低氧環(huán)境，生長和代謝均受到影響，從而產生一系列不適癥狀。本實驗中觀察到低氧組動物生長遲緩，在實驗8周時，體重出現(xiàn)輕微下降，并顯著低于常氧組，這可能與低氧環(huán)境下實驗動物產生少食倦怠等一系列不適癥狀有關。高原環(huán)境應激因素增多，一方面使分解代謝增強，合成代謝減少，直接增加基礎代謝率，另一方面可以引起機體的神經內分泌反應，影響攝食和代謝，從而影響機體的生長發(fā)育[5]。

與以往常用的大鼠磨牙牙周炎模型[5]不同，本研究采用正畸結扎兔雙下頜中切牙聯(lián)合牙周炎食譜的方法，實驗8周后成功建立兔牙周炎動物模型。此方法便于操作和實時觀察，同時局部未接種致病原、注射致炎細胞因子或全身應用激素，使牙周炎致病的多因素局限化，能更有效地研究牙周炎發(fā)病過程中的免疫因素。

一些研究[6-7]表明，高原低氧環(huán)境對牙周炎的發(fā)生、發(fā)展有一定影響。在高海拔地區(qū)，缺氧會增加機體的氧化壓力，影響代謝平衡。生理情況下，氧自由基作為機體代謝的產物，產生和清除保持平衡，吞噬細胞在防御中產生的一定量氧自由基還具有殺菌作用；在感染、損傷等病理情況下，過多氧自由基堆積會對機體產生損傷。牙周炎癥時，過多的超氧自由基不能被及時清除，對牙周組織產生損傷。氧自由基的損傷方式主要有以下兩種：一是使細胞脂質過氧化，破壞細胞膜上的糖和蛋白，改變細胞和血管通透性，從而影響細胞的代謝和功能，導致細胞變性壞死[8]；二是作為間接細胞信使參與細胞信號轉導，調節(jié)NF-κB信號通路[9-10]，誘導炎性介質的合成與釋放，這些炎癥介質又反過來增加氧自由基產生，從而放大炎癥反應[10-12]，通過直接破壞牙周組織細胞和間接的免疫損傷導致牙周炎的發(fā)生和發(fā)展。

機體的抗氧化酶系統(tǒng)有SOD、過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）[13]，其中SOD是目前發(fā)現(xiàn)的唯一以氧自由基為底物的酶，能使氧自由基歧化為H2O2，再由CAT和GSH-Px催化轉化為氧和水。SOD在機體氧化和抗氧化平衡中起關鍵作用，能直接清除氧自由基，保護組織和細胞免受損傷。高等動物體內含兩種SOD，即CuZn-SOD和Mn-SOD，因此T-SOD活力代表機體抗氧化酶系統(tǒng)對氧化的應激能力和清除氧自由基的能力，是反映機體抗氧化能力的標志。SOD作為生物大分子，其活性受到多種因素影響，在感染、輻射、衰老等因素下，其合成和活力均下降，機體清除氧自由基的能力降低，使氧自由基在體內大量堆積，造成組織損傷[14-16]。

本實驗通過模擬高原環(huán)境建立兔牙周炎模型，發(fā)現(xiàn)低氧實驗組兔血清和牙齦組織中T-SOD活力較其余各組明顯降低（P＜0.05），其活力與AL顯著負相關（P＜0.01），且牙齦組織和血清中T-SOD活力呈正相關（P＜0.01）。這些結果表明，與平原常氧環(huán)境相比，高原缺氧環(huán)境下出現(xiàn)牙周炎癥時，T-SOD活力都顯著降低，且其活力的改變在局部組織與全身一致，加之中性粒細胞的呼吸暴發(fā)，使機體氧自由基相對或絕對增多，這加重了高原環(huán)境下牙周組織的破壞，同時這也是加重其他高原病的可能原因。SOD廣泛存在于自然界，其活力可受多種方式調節(jié)，利用分子修飾和脂質體制備的手段增強SOD活力或作為輔助添加劑[16]，能促進局部組織清除過多有害物質，這為高原環(huán)境下牙周炎的預防和治療提供了新的思路。

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