張彥妮，韓榮娜

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

鈍葉瓦松(Orostachysmalacophyllus)[1]為景天科瓦松屬的二年生肉質(zhì)草本植物。在我國東北、華北、內(nèi)蒙古等地區(qū)均有分布，朝鮮、日本也有分布[2]。鈍葉瓦松系旱生植物，在內(nèi)蒙古典型草原和草甸草原地區(qū)，為常見的伴生種，生于礫石性山坡或沙礫質(zhì)土壤。全草皆可入藥，有止血通經(jīng)之功效[3]。鈍葉瓦松第1年僅有蓮座葉，第2年抽莖[4]。葉片呈蓮座狀密集排列，總狀花序，花期在夏秋季節(jié)，開白色或者白綠色小花[5]。可作為花壇花卉植于山坡、巖石園或屋頂，是一種頗具開發(fā)價值的野生花卉。迄今為止，對景天科瓦松屬植物的組織培養(yǎng)研究較少，曲偉紅和趙建國[6]對瓦松愈傷組織的誘導(dǎo)進行了研究，而對于鈍葉瓦松組織培養(yǎng)方面尚未見報道。由于野生資源有限，為了快速繁殖出大量的鈍葉瓦松植株，本試驗以帶芽葉片為材料，進行組織培養(yǎng)研究，以期為鈍葉瓦松大量繁殖提供新的有效途徑，為優(yōu)良種質(zhì)資源保存、野生資源的保護以及鈍葉瓦松可持續(xù)開發(fā)利用的實現(xiàn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗材料 鈍葉瓦松的植株由東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院花圃提供。選取健康的鈍葉瓦松帶芽葉片為外植體。

1.2試驗方法

1.2.1帶芽葉片消毒時間的篩選 參照程林梅等[7]方法，將采集的鈍葉瓦松帶芽葉片用洗衣粉水浸泡10 min，在流水下沖洗1～2 h后，放入超凈工作臺，用75%的乙醇溶液消毒15～30 s，再用無菌水沖洗2次，再用0.1%的升汞(HgCl2)溶液分別消毒3、5、7、9、11 min，中間不斷晃動，然后用無菌水沖洗5～6次，無菌濾紙吸干外植體表面的水分，用消毒過的小刀將帶有腋芽的葉片切成大小約為0.5～1.0 cm的小塊，接種到MS培養(yǎng)基上。每個處理30個外植體，重復(fù)3次。2周后分別統(tǒng)計不同消毒時間的污染率、啟動率和死亡率。篩選出外植體最佳的消毒時間。本試驗培養(yǎng)基pH值均調(diào)至5.8～6.0，高壓滅菌(1.1 MPa，121 ℃)15 min。培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強度為1 500～2 000 lx，光照時間為16 h·d-1。

1.2.2鈍葉瓦松帶芽葉片的啟動培養(yǎng) 將消毒后的帶芽葉片接種到添加不同質(zhì)量濃度6-BA(1.0、2.0和3.0 mg·L-1)、NAA(0.1、0.3和0.5 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基上，試驗采取二因素三水平的正交試驗設(shè)計，每處理接種30個外植體，30 d后統(tǒng)計鈍葉瓦松帶芽葉片的啟動率、出芽指數(shù)和出愈率。出芽指數(shù)等于發(fā)生芽的外植體上出芽數(shù)的平均數(shù)。

1.2.3腋芽的增殖培養(yǎng) 初代培養(yǎng)得到的腋芽，剪下后接種增殖培養(yǎng)基上進行叢芽的誘導(dǎo)，試驗采用三因素三水平的正交試驗設(shè)計，每處理接種30個外植體，30 d后統(tǒng)計腋芽的增殖倍數(shù)。

1.2.4組培苗的生根誘導(dǎo) 將高3 cm左右、未生根的組培苗轉(zhuǎn)至1/2MS +NAA(0.1、0.3 mg·L-1)培養(yǎng)基上進行生根誘導(dǎo)。20 d后分別統(tǒng)計生根率、根長及生根情況。

1.2.5無菌苗的移栽 選取高3 cm左右、根系健壯的鈍葉瓦松無菌生根苗進行移栽。用鑷子小心的取出生根苗，自來水沖洗掉根上附著的培養(yǎng)基，移栽到事先準備好的基質(zhì)中，澆適量水，放置在通風(fēng)良好、濕度較大、光照充足的環(huán)境下進行培養(yǎng)，觀察幼苗生長情況，30 d后統(tǒng)計移栽成活率，篩選出適宜的移栽基質(zhì)。

1.3數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用EXCLE、SPSS 17.0軟件進行方差分析及多重比較分析(Duncan’s法)。

2 結(jié)果

2.1鈍葉瓦松帶芽葉片消毒時間的篩選 隨著0.1% HgCl2處理時間的延長，鈍葉瓦松葉片的污染率逐漸遞減，啟動率呈先升后降的趨勢(表1)，而死亡率卻逐漸增加，可見，HgCl2消毒效果雖然較好，但對外植體的活化等方面影響很大，如果消毒時間過長，就會在殺死外植體表面微生物的同時對植物細胞也造成損傷，導(dǎo)致外植體死亡率的增加，從而影響到外植體愈傷組織的誘導(dǎo)。0.1%HgCl2處理5 min污染率和死亡率均較低，方差分析結(jié)果顯示，0.1%HgCl2處理5 min污染率與其他滅菌時間相比差異顯著，且啟動率最高,為56.67%，有利于帶芽葉片的啟動培養(yǎng)。說明0.1%HgCl2處理5 min最適合鈍葉瓦松帶芽葉片的消毒。

表1 不同滅菌時間對外植體消毒效果的影響及方差分析結(jié)果

2.2鈍葉瓦松帶芽葉片的啟動培養(yǎng) 將帶芽鈍葉瓦松葉片接種到不同激素組合的培養(yǎng)基上4 d左右，腋芽開始萌動，10 d左右差異并不顯著，有些腋芽基部開始產(chǎn)生愈傷組織經(jīng)繼代后會分化出根和不定芽(圖1)。其中在A1、A3、A6和A9培養(yǎng)基上腋芽的萌發(fā)率均較高，但A1和A9腋芽長勢一般，A3、A6出芽指數(shù)相對較高且腋芽長勢較好(表2)，可見高質(zhì)量濃度的6-BA有利于鈍葉瓦松腋芽的萌發(fā)與生長，而高質(zhì)量濃度的NAA(超過0.1 mg·L-1)對于鈍葉瓦松腋芽生長有抑制作用。因此高質(zhì)量濃度的6-BA(3.0 mg·L-1)和低質(zhì)量濃度的NAA(0.1 mg·L-1)組合是鈍葉瓦松帶芽葉片啟動的最佳培養(yǎng)基。

2.3腋芽的增殖培養(yǎng) 不同質(zhì)量濃度6-BA、NAA和 2,4-D的組合對于腋芽的增殖及苗的長勢影響相差很大。高質(zhì)量濃度的6-BA(1.5 mg·L-1)和NAA(0.1～0.2 mg·L-1)組合使用有利于帶芽葉片腋芽的增殖，隨著6-BA質(zhì)量濃度的升高，腋芽增殖倍數(shù)呈增加的趨勢，最高達5.35。方差分析表明，此組合與其他組合之間存在顯著差異，且苗長勢很好(圖2A)。但是當?shù)唾|(zhì)量濃度的6-BA(0.5 mg·L-1)或6-BA與2,4-D組合使用時，腋芽增殖倍數(shù)較小，芽苗長勢也較弱，可見在腋芽增殖時低質(zhì)量濃度的6-BA 或6-BA+2,4-D對于鈍葉瓦松葉片腋芽的增殖有抑制作用(表3)。因此最適宜帶芽葉片腋芽增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。

表2 帶芽葉片的啟動培養(yǎng)結(jié)果

2.4組培苗的生根誘導(dǎo) 叢生芽中未生根的苗高3 cm左右時，繼代到附加不同質(zhì)量濃度NAA(0.1～0.3 mg·L-1)的1/2MS培養(yǎng)基中進行生根誘導(dǎo)。試驗中發(fā)現(xiàn)鈍葉瓦松無菌苗較易生根，在接種后4 d左右開始生根，20 d后統(tǒng)計結(jié)果，大部分苗已經(jīng)生根，且生根率均在75%以上，其中，C3培養(yǎng)基的生根率最高，達96.67%，且平均誘導(dǎo)出14條根(表4)，從方差分析可以看出，C3培養(yǎng)基的生根率與C1、C2培養(yǎng)基之間存在顯著差異，且誘導(dǎo)出的根較粗狀數(shù)量較多(圖2B)。因此鈍葉瓦松最適生根培養(yǎng)基為：1/2MS+NAA 0.3 mg·L-1。

2.5組培苗的移栽 選擇生根良好的鈍葉瓦松生根苗移栽到不同的基質(zhì)中，30 d后統(tǒng)計不同移栽基質(zhì)的移栽成活率?；|(zhì)珍珠巖∶蛭石∶田間土(1∶1∶1)的移栽成活率最高，達76.67%(表5)，與另外3種基質(zhì)的成活率之間存在顯著差異，且苗的長勢較好(圖2C)。

圖1 愈傷組織增殖(A)和分化(B)

表3 帶芽葉片不定芽的增殖培養(yǎng)

圖2 鈍葉瓦松帶芽葉片腋芽的增殖(A)、生根誘導(dǎo)(B)及移栽(C)

表4 生根試驗結(jié)果

表5 不同栽培基質(zhì)對組培苗移栽成活率的影響

3 討論與結(jié)論

關(guān)于景天科植物組織培養(yǎng)方面的試驗研究已有很多的報道[8-10]，國內(nèi)外有關(guān)瓦松屬植物的研究報道更多是圍繞藥理及分子方面[11-12]，關(guān)于組培方面的報道卻很少。本試驗以鈍葉瓦松帶芽葉片為外植體，經(jīng)過多次試驗研究，初步建立了組織培養(yǎng)再生體系，短期內(nèi)獲得了大量的鈍葉瓦松的完整植株。

在鈍葉瓦松帶芽葉片的培養(yǎng)中，用0.1%升汞對外植體消毒5 min污染率較低且啟動率較高，滅菌效果最好。在帶芽葉片的啟動試驗中發(fā)現(xiàn)：帶芽葉片接種4 d左右，腋芽開始萌動，10 d左右葉片展開；另外試驗中發(fā)現(xiàn)激素種類和濃度對于葉片腋芽啟動培養(yǎng)有一定的影響，結(jié)果表明，高質(zhì)量濃度的6-BA(3.0 mg·L-1)和低質(zhì)量濃度的NAA(0.1 mg·L-1)組合使用腋芽萌發(fā)率最高，最適宜鈍葉瓦松帶芽葉片的啟動培養(yǎng)。有些腋芽在培養(yǎng)10 d左右，基部會產(chǎn)生黃綠色或綠色顆粒狀的愈傷組織，結(jié)構(gòu)致密但易碎，經(jīng)過繼代后會分化出根和不定芽，初步認定為胚性愈傷組織[13-15]。因此，有關(guān)葉片腋芽基部產(chǎn)生的是否為胚性愈傷組織以及進一步提高胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率尚待進一步深入研究。

植物生長調(diào)節(jié)劑在組織培養(yǎng)的過程中有著重要的作用[16]。不同的激素組合對于腋芽增殖的效果各不相同[17]。對鈍葉瓦松來說，在培養(yǎng)基MS+6-BA 1.50 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1上，腋芽增殖效果最好，增殖倍數(shù)為5.35，顯著高于其他組合的增殖倍數(shù)，苗的長勢也較好，因此是鈍葉瓦松帶芽葉片腋芽增殖的最佳培養(yǎng)基。在鈍葉瓦松組培苗的生根試驗中發(fā)現(xiàn)，NAA有利于促進鈍葉瓦松植株的生根，其生根的最適培養(yǎng)基為1/2MS+ NAA 0.3 mg·L-1，20 d后生根率高達96.67%，且根系粗壯、苗長勢較好。試驗苗移栽在基質(zhì)珍珠巖∶蛭石∶田間土(1∶1∶1)中效果最好，成活率達到76.67%。

本試驗以鈍葉瓦松的帶芽葉片為外植體，首次成功的建立了組織培養(yǎng)再生體系，為組培苗的移栽、大面積的人工栽培及其工廠化生產(chǎn)提供了一定的理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)，為鈍葉瓦松的可持續(xù)開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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