于 靜 張明昌

正常情況下的角膜是透明的、無血管的;在外傷、感染等病理情況下，角膜易形成角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)，不僅嚴(yán)重影響視力，而且CNV會破壞角膜正常微環(huán)境，使眼前節(jié)相關(guān)免疫赦免偏離消失，顯著增加角膜移植片排斥反應(yīng)的危險性［1-2］。CNV所導(dǎo)致的失明已成為目前眼科疾病防治領(lǐng)域亟待解決的重大課題之一?？鄥A是豆科植物苦參中的主要活性成分，具有抗炎、抗纖維化、抑制腫瘤生長等多種藥理作用，臨床應(yīng)用普遍。本實(shí)驗(yàn)通過研究苦參堿對大鼠CNV的抑制作用，旨在為該藥在眼科疾病的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及原料 苦參堿原料藥粉劑購自Sigma公司;小鼠抗人VEGF單克隆抗體，SABC免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京博奧森公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組 Wistar大鼠32只，購自同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，雌雄不限，體質(zhì)量150～200 g，健康無眼疾;隨機(jī)分成對照組、實(shí)驗(yàn)組0.2(0.2 mg苦參堿，0.02 mL)、實(shí)驗(yàn)組0.4(0.4 mg苦參堿，0.04 mL)、實(shí)驗(yàn)組0.8(0.8 mg苦參堿，0.08 mL)，每組8只。造模后4 d開始實(shí)驗(yàn)組分別每天結(jié)膜下注射0.2 mg、0.4 mg、0.8 mg苦參堿溶液，對照組給予生理鹽水(0.02 mL)。各組動物分別在造模后4 d、7 d、14 d、21 d斷頸處死取角膜組織，2/3角膜用40 g·L－1多聚甲醛溶液于4℃條件下固定24 h，常規(guī)石蠟包埋后作蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學(xué)分析及計算機(jī)分析;另1/3角膜置于液氮罐中保存，備作RT-PCR分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建立堿燒傷后CNV形成模型 用體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛3 mL·kg－1腹腔注射后誘導(dǎo)麻醉，將直徑3.0 mm濾紙浸入1 mol·L－1氫氧化鈉溶液中1 min，貼敷角膜中央20 s后取下，生理鹽水充分沖洗結(jié)膜囊1 min。所有實(shí)驗(yàn)對象均選右眼，左眼作為正常參照，造模后第2天起即用氯霉素滴眼液滴眼，預(yù)防感染。

1.3.2 CNV觀察 在手術(shù)顯微鏡下動態(tài)觀察CNV生長情況，分別于造模后4 d、7 d、14 d和21 d對CNV進(jìn)行拍照，根據(jù)公式計算CNV面積:S=C/12× 3.1416×［r2－(r－l)2］，S為CNV生長面積，C為血管網(wǎng)的跨圓周鐘點(diǎn)數(shù)，r為角膜半徑，l為CNV長度。

1.3.3 角膜組織病理學(xué)檢查 造模后不同時間點(diǎn)選不同劑量的苦參堿實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)處死2只大鼠，摘除眼球，取出角膜，40 g·L－1多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察。每張切片隨機(jī)選6個視野，進(jìn)行CNV密度計數(shù)。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色 采用標(biāo)記鏈親和素-生物素法(SABC法)。切片用PBS清洗5 min;體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫甲醇浸泡20 min，蒸餾水清洗3次，PBS浸洗;滴加含體積分?jǐn)?shù)3%非免疫血清封閉液，室溫孵育20 min，加入抗VEGF一抗(1∶100鼠抗人VEGF單克隆抗體)，－4℃過夜，PBS洗5 min×3次;加生物素化二抗(生物素化羊抗鼠IgG)，37℃濕盒孵育60 min，PBS洗5 min×3次;加SABC試劑，37℃濕盒孵育60 min，PBS洗5 min×3次;DAB顯色:室溫下顯色，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察，攝影。一抗用小鼠IgG代替作為陰性對照。以細(xì)胞呈棕黃色染色為陽性。切片在光鏡下按統(tǒng)一放大倍數(shù)觀察陽性染色的炎性細(xì)胞，VEGF陽性表達(dá)表現(xiàn)為棕黃色顆粒，將VEGF染色結(jié)果輸入計算機(jī)，通過多媒體醫(yī)用彩色圖像病理分析系統(tǒng)(HMIAS-2000)，每張切片隨機(jī)選6個視野，測量VEGF平均光密度(OD)值。

1.3.5 RT-PCR 參照Trizol試劑說明書提取總RNA，用紫外分光光度儀檢測濃度和純度，取2 μg總RNA，用RT-PCR說明書進(jìn)行操作。VEGF上游引物:5’-CGACAGAAGGGGAGCAGAAAG-3’，下游引物:5’-GCACTCCAGGGCTTCATCATT-3’;內(nèi)參β-actin上游引物:5’-GAGCTATGAGCTGCCTGACG-3’，下游引物:5’-AGCACTTGCGGTCCACGATG-3’。反應(yīng)條件為:94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，重復(fù)30個循環(huán)，72℃10 min。紫外線下通過DNA成像系統(tǒng)掃描，計算VEGF mRNA/β-actin mRNA的像素比值。

2 結(jié)果

2.1 CNV生長情況 對照組大鼠在造模后4 d后可見角鞏緣處有新生血管芽呈毛刷狀侵入透明角膜區(qū);7 d CNV生長最為旺盛，顯著變長、粗大，面積增加;14 d CNV面積達(dá)到最大，交織呈網(wǎng)狀(圖1A);到21 d CNV基本穩(wěn)定，部分血管已消退。而實(shí)驗(yàn)組造模后4 d CNV開始侵入透明角膜區(qū)，但較對照組稀疏;7 d CNV生長細(xì)小，短而稀疏，多集中于角膜緣且生長緩慢，其生長長度及密度明顯低于對照組;到14 d CNV面積增大，但并未交織呈網(wǎng)狀(圖1B);21 d CNV未明顯向角膜中央進(jìn)展，部分新生血管已退化。造模后實(shí)驗(yàn)組大鼠在各時間點(diǎn)的CNV面積均小于對照組，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＜0.01);實(shí)驗(yàn)組0.2的CNV面積明顯大于實(shí)驗(yàn)組0.4和實(shí)驗(yàn)組0.8(均為P＜0.01)，而實(shí)驗(yàn)組0.4和實(shí)驗(yàn)組0.8之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(q=1.586 0、0.972 2、3.070 0、2.558 1;見表1)。所有實(shí)驗(yàn)組未觀察到與注射苦參堿相關(guān)的副作用。

2.2 角膜組織病理學(xué)檢查結(jié)果 對照組大鼠4 d時角膜可見大量炎性細(xì)胞及少量新生血管，7 d時可見新生血管增多，14 d見大量新生血管，管腔粗大、內(nèi)有紅細(xì)胞(圖2A)，21 d時新生血管基本穩(wěn)定;各實(shí)驗(yàn)組在4 d時可見有炎性細(xì)胞侵潤及少量新生血管，7 d時可見新生血管，14 d時見較少新生血管管腔，管腔小，排列稀疏(圖2B-2D)，21 d時部分新生血管已退化。造模后14 d，對照組與實(shí)驗(yàn)組0.2、實(shí)驗(yàn)組0.4、實(shí)驗(yàn)組 0.8 CNV密度計數(shù)平均值分別是21.11±2.14、17.83±2.32、11.00±2.37、10.87± 2.41，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);實(shí)驗(yàn)組0.4和實(shí)驗(yàn)組0.8比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

Figure 1 CNV at 14 days after alkali burn in control group and experimental group with 0.4 mg Matrine 堿燒傷后第14天，對照組(A)和苦參堿實(shí)驗(yàn)組0.4(B)角膜CNV

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 在正常角膜組織中，VEGF在上皮及基質(zhì)中有微弱表達(dá)，對照組造模后4 d角膜上皮層及淺基質(zhì)層可見VEGF表達(dá)，7 d角膜基質(zhì)層內(nèi)VEGF表達(dá)顯著增加，14 d角膜基質(zhì)層內(nèi)可見大量VEGF表達(dá)(圖3A)，21 d角膜基質(zhì)層內(nèi)VEGF表達(dá)趨于下降。各實(shí)驗(yàn)組角膜VEGF表達(dá)均較對照組明顯減少(圖3B-3D)。且造模后各時間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組角膜VEGF的平均光密度值均小于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組0.2的VEGF平均光密度值明顯大于實(shí)驗(yàn)組0.4 (P＜0.05)，而實(shí)驗(yàn)組0.4和實(shí)驗(yàn)組0.8比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(q=1.1127、2.8285、0.7273、0.6447;見表2)。

2.4 RT-PCR結(jié)果 對照組大鼠角膜中VEGF mRNA的表達(dá)隨時間延長逐漸增加，到造模后14 d達(dá)到高峰，隨后出現(xiàn)下降。當(dāng)采用苦參堿干預(yù)后，角膜中VEGF mRNA的表達(dá)量明顯減少，并隨著苦參堿的藥物濃度增加，VEGF mRNA的表達(dá)逐漸減少(圖4、表3)。

表1 不同時間點(diǎn)的CNV面積Table 1 CNV area at different time points (s，S/mm2)

表1 不同時間點(diǎn)的CNV面積Table 1 CNV area at different time points (s，S/mm2)

Group n The 4th day The 7th day The 14th day The 21st day Control 6 10.25±0.15 19.60±1.31 26.18±1.28 25.89±1.38 Experimental 0.2 6 7.81±0.14 14.75±1.95 22.44±1.36 21.78±1.29 Experimental 0.4 6 6.54±0.14 10.33±1.40 16.19±1.37 15.53±1.34 Experimental 0.8 6 6.48±0.14 9.98±1.05 15.58±1.37 14.66±1.41 F 8.051 7 7.854 1 27.585 3 7.610 0 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 不同時間段角膜VEGF的表達(dá)Table 2 Corneal VEGF expression at different time points (s)

表2 不同時間段角膜VEGF的表達(dá)Table 2 Corneal VEGF expression at different time points (s)

Group n The 4th day The 7th day The 14th day The 21st day Control 6 0.341 4±0.001 3 0.531 9±0.001 4 0.6523±0.001 4 0.584 2±0.001 4 Experimental 0.2 6 0.284 1±0.001 3 0.421 1±0.001 3 0.532 9±0.001 5 0.498 1±0.015 3 Experimental 0.4 6 0.212 8±0.001 4 0.301 4±0.001 3 0.403 2±0.001 3 0.354 2±0.003 0 Experimental 0.8 6 0.202 4±0.001 3 0.301 0±0.001 4 0.402 8±0.001 4 0.353 4±0.011 8 F 46.575 2 69.897 3 4.478 2 9.160 6 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01

Figure 2 Corneal HE staining at 14 days after alkali burn in control group and experimental group(×200).A:In control group，thick and intensive new vessels were seen in corneal stroma，and inflammatory cells filtration was also found;B:In experimental group with 0.2 mg Matrine，few new vessels and inflammatory cells were seen;C，D:In experimental groups with 0.4 mg and 0.8 mg Matrine，few new vessels in corneal stroma were seen 堿燒傷后14 d，對照組和苦參堿實(shí)驗(yàn)組角膜HE染色(×200)。A:對照組角膜基質(zhì)內(nèi)新生血管數(shù)量多，管腔較粗大，并有大量炎性細(xì)胞浸潤;B:實(shí)驗(yàn)組0.2角膜基質(zhì)內(nèi)新生血管數(shù)量少，管腔小且基質(zhì)層內(nèi)炎性細(xì)胞少;C、D:實(shí)驗(yàn)組0.4和實(shí)驗(yàn)組0.8角膜基質(zhì)層新生血管明顯減少

Figure 3 Corneal VEGF immunohistochemistry at 14 days after alkali burn in control group and experimental group(×200).A:In control group，the strong positive expression of VEGF was seen in corneal stroma;B:In experimental group with 0.2 mg Matrine，the positive expression of VEGF in corneal stroma reduced;C，D:In experimental groups with 0.4 mg and 0.8 mg Matrine，the positive expression of VEGF in corneal stroma reduced obviously 堿燒傷后14 d，對照組和苦參堿實(shí)驗(yàn)組角膜VEGF免疫組織學(xué)化染色結(jié)果(×200)。A:對照組角膜基質(zhì)層區(qū)域VEGF呈強(qiáng)陽性表達(dá);B:實(shí)驗(yàn)組0.2角膜基質(zhì)層區(qū)域VEGF表達(dá)減少;C、D:實(shí)驗(yàn)組0.4和實(shí)驗(yàn)組0.8角膜基質(zhì)層區(qū)域VEGF表達(dá)明顯減少

Figure 4 VEGF mRNA level at different time points.A:Control group;B:Experimental group with 0.2 mg Matrine;C:Experimental group with 0.4 mg Matrine;D:Experimental group with 0.8 mg Matrine 不同時間點(diǎn)VEGF mRNA水平。A:對照組;B:實(shí)驗(yàn)組0.2;C:實(shí)驗(yàn)組0.4;D:實(shí)驗(yàn)組0.8)

表3 不同時間點(diǎn)角膜VEGF mRNA的表達(dá)Table 3 Corneal VEGF mRNA expression at different time points (s)

表3 不同時間點(diǎn)角膜VEGF mRNA的表達(dá)Table 3 Corneal VEGF mRNA expression at different time points (s)

Group n Ratio of VEGF mRNA/β-actin mRNA The 4th day The 7th day The 14th day The 21st day Control 6 0.270±0.013 0.390±0.024 0.430±0.025 0.400±0.037 Experimental 0.2 6 0.190±0.011 0.300±0.018 0.340±0.014 0.310±0.025 Experimental 0.4 6 0.160±0.014 0.250±0.013 0.290±0.013 0.280±0.015 Experimental 0.8 6 0.130±0.010 0.170±0.015 0.200±0.021 0.180±0.011 F 26.556 29.873 3.645 6.374 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01

3 討論

苦參堿是近年來從中藥豆科植物苦參、苦豆子和廣豆根中分離提取的有效單體成分，具有多種藥理活性［3］。它有類似于糖皮質(zhì)激素的直接抗炎作用［4］，對多部位成纖維細(xì)胞的增生具有抑制作用，對多種惡性腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，同時，苦參堿還對多種細(xì)菌和病毒有明顯的抑制作用。蔣瑤祁等［5］發(fā)現(xiàn)苦參堿通過下調(diào)VEGF的表達(dá)抑制視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，且對高糖引起的VEGF表達(dá)上調(diào)同樣存有抑制作用，增加了其眼表使用的可行性。

Edelman等［6］研究發(fā)現(xiàn)，化學(xué)燒傷后24 h以內(nèi)為非增生期，出現(xiàn)角膜水腫和混濁但無CNV，第2－4天為CNV增生期，第7天達(dá)到高峰，之后為血管退行期，CNV逐漸退行吸收。本實(shí)驗(yàn)的大鼠堿燒傷模型具有類似的角膜急性炎癥反應(yīng)，但堿燒傷CNV的高峰期持續(xù)時間更長，造模后7～14 d達(dá)到高峰期，之后才見CNV消退。本實(shí)驗(yàn)在蛋白水平和基因水平均證實(shí)苦參堿對CNV中VEGF的表達(dá)有明顯抑制作用。實(shí)驗(yàn)組免疫組織化學(xué)染色的平均光密度值圖像分析顯示，在堿燒傷模型中，VEGF表達(dá)有其變化過程，并和宏觀觀察CNV面積變化基本同步。VEGF在造模后14 d表達(dá)量最高，21 d開始下降，與對照組比較，各實(shí)驗(yàn)組在造模后4 d、7 d、14 d和21 d差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;但并未見實(shí)驗(yàn)組0.4和實(shí)驗(yàn)組0.8之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其原因可能是因?yàn)閮山M在這階段VEGF的表達(dá)均已明顯下降并趨于穩(wěn)定。

正常角膜中，VEGF在上皮、基質(zhì)和角膜緣血管內(nèi)皮細(xì)胞有表達(dá)，其受體是兩種酪氨酸激酶受體: fms樣酪氨酸激酶1(fms-like tyrosine kinase，flt-1)和胎肝激酶1(fetal liver kinase 1，flk-1)，這兩種受體在角膜緣血管內(nèi)皮細(xì)胞上有表達(dá)［7］。VEGF的作用在于它可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌蛋白酶和蛋白酶原活化因子，從而導(dǎo)致血管基底膜的降解，細(xì)胞得以侵入周圍基質(zhì)，遷移、增生，最終分化成一個新的、含有一個空腔的血管［8］。在多種原因引起的CNV中，VEGF mRNA及其蛋白在浸潤的白細(xì)胞、新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)明顯升高［9］，因此本實(shí)驗(yàn)從基因水平下半定量檢測VEGF mRNA表達(dá)情況，每個實(shí)驗(yàn)組角膜中VEGF mRNA的表達(dá)隨時間延長逐漸增加，到造模后14 d達(dá)到高峰，隨后出現(xiàn)下降。當(dāng)采用苦參堿干預(yù)后，角膜中VEGF mRNA的表達(dá)量明顯減少，并隨著苦參堿的藥物濃度增加，VEGF mRNA的表達(dá)逐漸減少，表明苦參堿能夠有效抑制VEGF mRNA的轉(zhuǎn)錄，降低VEGF的表達(dá)，阻礙內(nèi)皮細(xì)胞的增生，從而抑制CNV的生長。這也可能是苦參堿抑制CNV生成的機(jī)制之一。

本研究結(jié)果表明，苦參堿可能通過降低VEGF的表達(dá)而達(dá)到抑制CNV生長的目的，為臨床上CNV的治療提供了一條新的參考途徑。

1 Panda A，Vanathi M，Kumar A，Dash Y，Priya S.Corneal graft rejection［J］.Surv Ophthalmol，2007，52(4):375-396.

2 Coster DJ，Williams KA.The impact of corneal allograft rejection on the long-term outcome of corneal transplantation［J］.Am J Ophthalmol，2005，140(6):1112-1122.

3 劉 梅，劉雪英，程建峰.苦參堿的藥理研究進(jìn)展［J］.中國中藥雜志.2003，28(9):801-804.

4 鄭馬慶，潘偉娜，朱延勤.苦參堿滴眼液對家兔實(shí)驗(yàn)性眼炎的藥效學(xué)研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2003，14(2):109-111.

5 蔣瑤祁，彭輝燦，肖啟國，李 萍，楊 杰.苦參堿對大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生VEGF表達(dá)的影響［J］.眼科研究，2008，26 (1):84-88.

6 Edelman JL，Castro MR，Wen Y.Correlation of VEGF expression by leukocytes with the growth and regression of blood vessels in the rat cornea［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1999，40(6): 1112-1123.

7 Van Setten GB.Vascular endothelial growth factor in normal human corneal epithelium:Detection and physiological importance［J］.Acta Ophthalmol Scand，1997，75(6):649-652.

8 何有娣.FGF和VEGF在血管生成中的作用［J］.國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊，2001，28(6):326-329.

9 Kvanta A，Sarman S，F(xiàn)agerholm P，Seregard S，Steen B.Expression of matrix metalloproteinase-2 and vascular endothelial growth factor in inflammation-associated corneal neovascularization［J］.Exp Eye Res，2000，70(4):419-428.