王蕊 王一

生物醫(yī)學(xué)人工合成的有機(jī)化學(xué)組織黏合劑在眼科的應(yīng)用研究已有40多年的歷史，因其使用方便、快捷、安全、廉價(jià)，已被用于角膜潰瘍、穿孔的治療和白內(nèi)障手術(shù)角膜切口的封閉［1-2］。黏合劑可以產(chǎn)生足夠的黏合力封閉角膜穿通傷口，但由于眼組織結(jié)構(gòu)精細(xì)復(fù)雜，生理功能特殊，理化因素的刺激可能引起眼部炎癥反應(yīng)和組織破壞，導(dǎo)致視功能的損傷。因此有必要對(duì)黏合劑黏合角膜穿通傷口眼前節(jié)的病理學(xué)改變及對(duì)眼前節(jié)的刺激性進(jìn)行研究。本研究采用α-氰基丙烯酸正辛酯與正丁酯混合醫(yī)用組織黏合劑封閉長(zhǎng)約5 mm角膜穿通傷口，并與10-0尼龍縫線縫合方法比較，評(píng)價(jià)醫(yī)用組織黏合劑治療角膜穿通傷對(duì)眼前節(jié)及角膜內(nèi)皮細(xì)胞和血-房水屏障的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 6月齡普通級(jí)日本大耳白兔20只，體質(zhì)量2.0～2.8 kg(平均2.43 kg)，雌雄不拘(第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。醫(yī)用膠由北京福愛(ài)樂(lè)科技發(fā)展有限公司提供，為福愛(ài)樂(lè)醫(yī)用膠。

1.2 分組及手術(shù)步驟 20只大耳白兔左眼為縫線組，右眼為醫(yī)用膠組。隨機(jī)分為7 d、14 d、30 d、90 d組，每組5只，單籠喂養(yǎng)。30 g·L－1戊巴比妥鈉行兔耳緣靜脈麻醉(30 mg·kg－1)，實(shí)驗(yàn)兔側(cè)臥于手術(shù)臺(tái)，固定四肢，剪除雙眼睫毛，氯霉素滴眼液沖洗結(jié)膜囊，鹽酸奧布卡因眼液滴一滴于結(jié)膜囊內(nèi)。常規(guī)消毒鋪巾，開(kāi)瞼器撐開(kāi)眼瞼，刮除角膜中央直徑約6 mm表面上皮，于角膜中央?yún)^(qū)(1∶00～7∶00鐘位)做一長(zhǎng)約5 mm全層切口，整齊對(duì)合傷口斷端，右眼醫(yī)用膠(1滴)涂于傷口表面，左眼10-0尼龍縫線縫合傷口3針，檢查傷口無(wú)滲漏后，金霉素眼膏涂于結(jié)膜囊。術(shù)后實(shí)驗(yàn)兔觀察至蘇醒，放回動(dòng)物房飼養(yǎng)。于術(shù)后7 d、14 d、30 d、90 d大體、角膜內(nèi)皮細(xì)胞共聚焦顯微鏡觀察及房水蛋白含量測(cè)定后，按照科學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的道德條例靜脈注射空氣處死動(dòng)物。取眼球行角膜內(nèi)皮細(xì)胞電鏡觀察。

1.3 大體觀察 術(shù)后于各時(shí)間觀察點(diǎn)，裂隙燈下觀察兔眼前節(jié)，20 g·L－1熒光素鈉染色觀察角膜傷口愈合過(guò)程及密閉性、醫(yī)用膠的降解和前房情況。

1.4 角膜內(nèi)皮細(xì)胞共聚焦顯微鏡觀察 3只實(shí)驗(yàn)兔于術(shù)后7 d、14 d、30 d，在全麻下用角膜共聚焦顯微鏡觀察角膜傷口周邊內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，并于每只眼球角膜傷口中央到兩側(cè)角膜緣終點(diǎn)的位置拍攝3張角膜內(nèi)皮細(xì)胞照片，采用Image-Pro plus5.0圖像處理軟件，計(jì)算角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度。

1.5 房水蛋白含量測(cè)定 術(shù)后7 d、30 d、90 d，每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)5只實(shí)驗(yàn)兔在全麻下用1 mL注射器從顳上側(cè)角鞏膜緣內(nèi)1 mm透明角膜處刺入前房，分別抽取左、右眼房水0.1 mL，分別置于EP管中－20℃冰箱冷存，待標(biāo)本收集后行鄰苯三酚紅鉬絡(luò)合法(PRM)檢測(cè)房水蛋白含量。

1.6 角膜內(nèi)皮細(xì)胞電鏡觀察 術(shù)后14 d和30 d分別取醫(yī)用膠組、縫線組兔各1只，迅速摘出眼球，分離角膜，于顯微鏡下取角膜傷口中央兩側(cè)1 mm處平行于傷口的1 mm×2 mm大小組織塊，置于4℃、25 g·L－1戊二醛中固定24 h以上，體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸固定2 h，4℃下進(jìn)行;經(jīng)脫水、置換、包埋、定位，超薄切片機(jī)制作50～60 nm超薄切片，飽和醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染色。PHILPS-CM10型透射電鏡觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞器情況并照相。

2 結(jié)果

2.1 角膜傷口大體觀察 術(shù)后7 d、14 d、30 d、90 d，醫(yī)用膠組和縫合組角膜傷口均密閉。裂隙燈檢查未見(jiàn)水樣液體從穿通傷口流出，前房深度未見(jiàn)異常。醫(yī)用膠塊于術(shù)后14 d邊緣部分脫落，術(shù)后90 d完全脫落。醫(yī)用膠組和縫線組術(shù)后角膜傷口愈合過(guò)程中均未見(jiàn)前房炎癥反應(yīng)及虹膜、晶狀體的異常改變。

2.2 角膜內(nèi)皮細(xì)胞共聚焦顯微鏡檢查 共聚焦顯微鏡下，內(nèi)皮細(xì)胞邊緣呈黑色，細(xì)胞體發(fā)亮，多數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)呈六邊形，但術(shù)后7 d和14 d醫(yī)用膠組和縫線組均可見(jiàn)部分內(nèi)皮細(xì)胞大小不一，密度無(wú)明顯變化(圖1-圖2)。術(shù)后30 d隨著傷口的愈合，內(nèi)皮細(xì)胞大小均勻，細(xì)胞密度亦無(wú)顯著變化。2組術(shù)后7 d、14 d、30 d角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05，見(jiàn)表1)。

Figure 1 Corneal endothelial cells in Cyanoacrylate group at 7 days after operation(×400) 醫(yī)用膠組術(shù)后7 d角膜內(nèi)皮細(xì)胞(× 400)

Figure 2 Corneal endothelial cells in suturing group at 7 days after operation(×400) 縫線組術(shù)后7 d角膜內(nèi)皮細(xì)胞(×400)

表1 術(shù)后7 d、14 d、30 d角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度比較Table 1 Comparison of corneal endothelial cells density at 7 days，14 days and 30 days after operation between two groups (n=3，s，cell·mm－2)

表1 術(shù)后7 d、14 d、30 d角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度比較Table 1 Comparison of corneal endothelial cells density at 7 days，14 days and 30 days after operation between two groups (n=3，s，cell·mm－2)

Note:Compared with CA group，△P＞0.05

Group 7 days 14 days 30 days CA 2567.33±193.37 2534.00±60.02 2480.67±67.24 Suture 2484.67±318.85△ 2570.00±364.90△ 2479.33±136.44△

2.3 蛋白含量測(cè)定結(jié)果 房水蛋白濃度在術(shù)后7 d最高，隨角膜傷口愈合逐漸降低，術(shù)后90 d恢復(fù)正常，各觀察時(shí)間點(diǎn)組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05，見(jiàn)表2)。

2.4 角膜內(nèi)皮細(xì)胞電鏡觀察 術(shù)后14 d，醫(yī)用膠組和縫線組均可見(jiàn)角膜基質(zhì)層膠原排列較整齊，可見(jiàn)成纖維母細(xì)胞，內(nèi)彈力層均勻。醫(yī)用膠組角膜內(nèi)皮細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核膜連續(xù)，染色深，核膜下異染色質(zhì)增多，但分布均勻。縫線組細(xì)胞漿內(nèi)少量線粒體腫脹，基質(zhì)疏松，內(nèi)嵴間隙增寬，可見(jiàn)小空泡樣變。僅有少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張(圖3-圖4)。術(shù)后30 d，醫(yī)用膠組和縫線組均可見(jiàn)角膜基質(zhì)層膠原排列整齊，可見(jiàn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)彈力層均勻。角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，胞膜連續(xù)，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，呈梭形，異染色質(zhì)在核膜下聚集，細(xì)胞器基本正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張不明顯，細(xì)胞漿內(nèi)線粒體未見(jiàn)明顯異常。

表2 術(shù)后7 d、30 d、90 d房水蛋白檢測(cè)結(jié)果比較Table 2 Comparison of protein content of aqueous humor in aqueous humor at 7 days，30 days and 90 days after operation between two groups (n=5，s，ρ/g·L－1)

表2 術(shù)后7 d、30 d、90 d房水蛋白檢測(cè)結(jié)果比較Table 2 Comparison of protein content of aqueous humor in aqueous humor at 7 days，30 days and 90 days after operation between two groups (n=5，s，ρ/g·L－1)

Note:Compared with CA group，△P＞0.05

Group 7 days 30 days 90 days CA 0.561±0.284 0.421±0.139 0.317±0.062 Suture 0.523±0.303△ 0.472±0.058△ 0.398±0.091△

Figure 3 Transmission electron microscope image of cyanoacrylate group at 14 days after operation(×17 000) 醫(yī)用膠組術(shù)后14 d角膜內(nèi)皮細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果(×17 000)

Figure 4 Transmission electron microscope image of suturing group at 14 days after operation(×24 000) 縫線組術(shù)后14 d角膜內(nèi)皮細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果(×24 000)

3 討論

3.1 醫(yī)用組織黏合劑(α-氰基丙烯酸酯)的理化性質(zhì)和組織相容性 α-氰基丙烯酸酯類組織黏合劑(CA)早在19世紀(jì)40年代就被研究用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。19世紀(jì)60年代首次應(yīng)用于眼科［3］。透明、無(wú)色、液體狀態(tài)下的單體黏合劑在應(yīng)用于生物組織時(shí)迅速發(fā)生單體放熱聚合反應(yīng)，發(fā)揮其黏接作用。α-氰基丙烯酸酯類組織黏合劑的組織刺激反應(yīng)主要由其發(fā)生聚合反應(yīng)時(shí)所釋放的聚合熱引起，與其烴基鏈的大小有關(guān)［4］。早期的短烴基鏈α-氰基丙烯酸酯(α-氰基丙烯酸甲酯等)由于毒性大，組織相容性差，限制了其在眼科的應(yīng)用。長(zhǎng)烴基鏈α-氰基丙烯酸酯類黏合劑是惰性的，比絲線和腸線引起的反應(yīng)要小得多［5］。α-氰基丙烯酸正辛酯是具有8個(gè)碳原子的烴基鏈，降解速度慢，聚合熱低，擴(kuò)散性好，聚合體表面較光滑，韌性好，具有更好的組織相容性和物理性能［6］。近幾年長(zhǎng)烴基鏈α-氰基丙烯酸酯(α-氰基丙烯酸正辛酯、α-氰基丙烯酸正丁酯等)已用于眼科研究，如角膜和鞏膜穿孔的治療、結(jié)膜傷口治療、視網(wǎng)膜脫離的治療、瞼成形術(shù)、義眼臺(tái)植入術(shù)，均取得了較好的療效［7-11］。

本實(shí)驗(yàn)使用的是以α-氰基丙烯酸正辛酯為主體的復(fù)合醫(yī)用膠，具有無(wú)致癌、致畸、致突變、并對(duì)11種細(xì)菌形成抑菌帶等優(yōu)點(diǎn)［12-13］，并具有聚合速度相對(duì)延長(zhǎng)、白化現(xiàn)象輕等特點(diǎn)，更利于手術(shù)操作和術(shù)后觀察。本研究中的α-氰基丙烯酸正辛酯和正丁酯復(fù)合膠及其降解物對(duì)眼前節(jié)局部刺激反應(yīng)與縫線組比較無(wú)明顯差別。

3.2 醫(yī)用組織黏合劑應(yīng)用于眼表的組織反應(yīng)

3.2.1 黏合劑對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的影響 角膜內(nèi)皮細(xì)胞是維持角膜正常形態(tài)和生理功能的基礎(chǔ)，黏合劑是否引起角膜內(nèi)皮細(xì)胞的病理變化是評(píng)價(jià)黏合劑對(duì)角膜組織影響的重要指標(biāo)之一。角膜內(nèi)皮損傷后，周邊的角膜內(nèi)皮細(xì)胞向受損區(qū)移行，14 d可完成修復(fù)過(guò)程。共聚焦顯微鏡檢查顯示:醫(yī)用膠組和縫線組角膜內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)無(wú)明顯變化，兩組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)。角膜內(nèi)皮細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果表明，黏合劑不引起內(nèi)皮細(xì)胞組織病理和超微結(jié)構(gòu)改變。Ollivier等［14］將黏合劑涂抹于伴基質(zhì)缺損的角膜表面，研究兔眼角膜對(duì)α-氰基丙烯酸正丁酯耐受的實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后20 d大體和組織學(xué)觀察示無(wú)明顯炎癥反應(yīng)。

3.2.2 黏合劑對(duì)血-房水屏障的影響 房水蛋白含量是評(píng)價(jià)血-房水屏障功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，能客觀反映前房有無(wú)炎癥反應(yīng)。前房的炎癥、虹膜睫狀體炎、眼外傷或內(nèi)眼手術(shù)后，由于血-房水屏障遭到破壞，使屏障通透性增強(qiáng)，房水蛋白含量可明顯增加［15］。本實(shí)驗(yàn)中醫(yī)用膠組和縫線組術(shù)后7 d房水蛋白含量高于術(shù)后90 d，是角膜外傷引起的，而不是黏合劑引起的。醫(yī)用膠組和縫線組房水蛋白含量在術(shù)后各觀察點(diǎn)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)。結(jié)果表明，醫(yī)用膠不引起房水蛋白增加，不引起前房炎癥反應(yīng)。

綜上所述，醫(yī)用組織黏合劑用于黏合角膜穿通傷口，具有良好的生物組織相容性，不引起角膜組織病理學(xué)改變和血-房水屏障的破壞。本研究為醫(yī)用組織黏合劑用于臨床治療奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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