李鵬飛，呂慧娜，韓立波

(1遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽110042;2中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院;3中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

Oct4是具有代表性的胚胎干細胞轉(zhuǎn)錄因子，它是 轉(zhuǎn)錄因子POU家族的一員，不但在胚胎于細胞、胚胎生殖細胞、胚胎和生殖腫瘤細胞中表達，亦在一些成人組織的祖細胞和原發(fā)腫瘤中表達［1］。Sox2，性別決定區(qū)因子，與Oct4一同在胚胎干細胞維持自我更新及多向性發(fā)展過程中起著決定性的作用，是維持膠質(zhì)瘤祖細胞增殖和遺傳特性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)Sox2以致癌基因的形式在多種腫瘤中表達［2］。這些基因特異性的表達于這個獨特的人類生命周期階段，而不表達于體細胞，可能對癌癥的治療有著潛在的巨大潛力。目前國外的研究主要集中在Oct4、Sox2調(diào)節(jié)基因表達的能力方面，且研究對象多為細胞系，而在實體瘤方面研究很少。已經(jīng)取得的研究結(jié)果表明Oct4、Sox2在部分胰腺癌、胃癌、乳腺癌及一些典型的腫瘤細胞系等中有一定程度的表達，并與腫瘤的發(fā)生有關(guān)［3～6］。關(guān)于Oct4、Sox2在肺癌組織中是否表達以及它們與肺癌進展及預(yù)后的相關(guān)性等問題目前尚未見報道。本實驗采用免疫組化的方法，對132例肺癌組織、42例癌旁組織及34例正常肺組織進行Oct4、Sox2的表達檢測，分析其表達情況和與病理類型、分化程度和臨床分期及預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 2002年9月～2008年5月在遼寧省腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的肺癌組織標本132例。所有病例為初次發(fā)病，術(shù)前無化療、放療及免疫治療史。其中男102例、女30例，年齡32～83歲、平均63.15歲。TNM標準分為:Tis～T1為7例，浸潤性腫瘤，T2～T4為125例，42例癌旁組織標本取距癌灶0.5 cm處，34例正常肺組織遠離癌灶5 cm處，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者52例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者80例。標本均經(jīng)病理證實。并以34例正常肺組織作對照，病理檢查證實是正常肺組織。兔源性O(shè)ct4、Sox2多克隆抗體購自Abcam公司，鏈霉卵白素-生物素過氧化物酶(SP)標記的二抗試劑盒及DAB均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。其他生化試劑采用國產(chǎn)分析純。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測 采用鏈霉素抗生素蛋白—過氧化物酶(SP)法，步驟如下:組織標本用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚4 mm。切片常規(guī)脫蠟、水化，水浴法進行抗原修復(fù)，修復(fù)后的切片用3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。用正常血清孵育封閉內(nèi)源性非特異性抗原，滴加Oct4、Sox2多克隆抗體(工作濃度均為1∶200)，4℃過夜。滴加二抗(采用抗兔SP試劑盒)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為空白對照，正常肺組織作為陰性對照。結(jié)果判斷:光鏡下觀察，Oct4、Sox2抗原陽性反應(yīng)為位于細胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色、棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性細胞。由染色深淺和陽性細胞所占百分比一起決定陽性反應(yīng)強度，判斷標準是每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)，每個視野數(shù)100個細胞，先按陽性細胞所占百分比評分:≤5%為0，6%～25%為1，26%～50%為2，51%～75%為3，≥76%為4;再按染色強度評分:不著色為0，淡黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3。最后按兩者乘積數(shù)將每個標本的表達強度分為4個等級:陰性(-)l級(0、1、2);弱陽性(+)2級(3、4);中度陽性(++)3級(6、8);強陽性(+++)4級(9、12)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用Prism5.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以s表示，陽性率之間的比較采用χ2檢驗，多組間比較采用方差分析。以P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Oct4、Sox2表達及與臨床病理特征關(guān)系 Oct4和Sox2在肺癌中均高表達，陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，Sox2主要表達于腺體的細胞質(zhì)，Oct4在胞質(zhì)及胞核內(nèi)均有表達。在34例正常肺組織中表達全部陰性，在132例肺癌中，Oct4陽性93例，Sox2陽性62例，陽性表達率70.45%和46.96%，在癌旁組織中陽性率為21.87%和30.22%，各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在132例肺癌中，Oct4和Sox2在不同腫瘤分級之間(T1～T4)的陽性表達率分別為5.34%和10.61%、15.97%和13.66%、43.18%和45.45%、87.50%和100.00%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Oct4、Sox2蛋白表達強度隨著與腫瘤的病理學(xué)分級增高而降低，呈負相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)，而與患者的年齡、性別、分化程度無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

2.2 生存分析 在Oct4、Sox2與患者5年生存率的單因素分析中，Oct4和Sox2的單獨陽性表達患者的5年總生存率為40.2%和24.8%，Oct4和Sox2的單獨表達并不能作為判斷預(yù)后的獨立因素(P=0.328和P= 0.171)，而他們的聯(lián)合表達，均陽性或均陰性的5年生存率為80.2%和21.3%，則可以作為判斷肺癌預(yù)后的獨立因素(P＜0.001)。TNM分期對于評估肺癌預(yù)后具有重要意義，為了找出能夠更準確預(yù)測肺癌術(shù)后患者生存質(zhì)量的分子標記物，我們通過多因素分析研究了Sox2和Oct4蛋白在不同TNM分期中的預(yù)后價值，多因素分析中，腫瘤分化程度、TNM分期為預(yù)后因素，Sox2和Oct4均陽性是明顯的獨立預(yù)后因素(P= 0.001)，Kaplan-Meier生存分析同樣支持上述結(jié)論，Sox2和Oct4表達均為陽性的患者生存率低于Sox2和Oct4均為陰性表達的患者(P＜0.01)。見圖1。

3 討論

近年來，有很多研究表明干細胞的分子印跡可以作為很多腫瘤的預(yù)后分子標記物，Sox2和Oct4作為早期胚胎發(fā)育和維持胚胎干細胞特征所必須的轉(zhuǎn)錄因子，二者均在消化道器官發(fā)育和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用［7］，Sox2表達也見于腺上皮內(nèi)瘤變和胰腺侵襲性導(dǎo)管癌［8］。Oct4在胃癌中表達高于癌旁組織、萎縮性胃炎和胃潰瘍［9］。Sox2在胃癌中表達下調(diào)，通過促進細胞周期阻滯和凋亡而抑制細胞生長。Sox2在結(jié)腸息肉、黏液腺癌和印戒細胞癌中高表達，通過上調(diào)MuC5AC發(fā)揮作用［10］。對于直腸癌手術(shù)前放化療的患者，Oct4、Sox2、CD133表達陽性對于直腸癌遠處復(fù)發(fā)與預(yù)后不良有預(yù)警價值［11］。此外，Oct4和Sox2還參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸道、泌尿生殖系統(tǒng)等多種腫瘤的發(fā)展［13～15］。本研究發(fā)現(xiàn)，Oct4與Sox2在肺癌組織中的表達明顯高于其癌旁組織，Oct4與Sox2蛋白表達強度隨著與腫瘤的病理學(xué)分級增高而降低，而與患者性別、年齡無關(guān)。

圖1 Sox2和Oct4表達與肺癌患者5年生存率的關(guān)系

Sox2和Oct4在很多腫瘤高表達但在正常體細胞不表達，在食管癌和直腸癌表達分析表明Sox2與Oct4表達明顯相關(guān)，進一步的研究發(fā)現(xiàn) Sox2或Oct4過表達會導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移能力和惡化程度增加，與多種腫瘤不良預(yù)后相關(guān)，我們的研究亦發(fā)現(xiàn)Sox2或Sox2/Oct4可作為肺癌的獨立預(yù)后因素，而Oct4不能作為生存率的獨立預(yù)后因素，可能是與樣本數(shù)不足有關(guān)，免疫組化結(jié)果確認了Sox2和Oct4的表達明顯高于肺癌癌旁，而正常組織不表達，表明Sox2和Oct4均可能參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程。Oct4、Sox2可能是通過協(xié)同作用促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，Oct4、Sox2特定的表達在多潛能細胞，除表達方式相似外，Oct4、Sox2有共同的結(jié)合位點，兩者協(xié)作調(diào)控大多數(shù)的靶基因的表達。Oct4、Sox2結(jié)合到相鄰的功能區(qū)，通過自身正反饋調(diào)控胚胎干細胞的多潛能性和自我更新能力。研究Oct4、Sox2功能機制不僅有利于多能干細胞技術(shù)的研究，為探討腫瘤發(fā)生機制提供了一條新的思路，對未來研究診斷和治療途徑也具有十分重要的意義。

［1］Bruix J，Boix L，Sala M，et al.Focus on hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Cell，2004，5(3):215-219.

［2］Mann CD，Neal CP，Garcea G，et al.Prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma:a systematic review［J］.Eur J Cancer，2007，43(6):979-992.

［3］Chambers I，Tomlinson SR.The transcriptional foundation of pluripotency［J］.Development，2009，136(14):2311-2322.

［4］Gangemi RM，Griffero F，Marubbi D，et al.Sox2 silencing in glioblastoma tumor-initiating cells causes stop of proliferation and loss of tumorigenicity［J］.Stem Cells，2009，27(1):40-48.

［5］Schmitz M，Temme A，Senner V，et al.Identification of Sox2 as a novel glioma-associated antigen and potential target for T cell-based immunotherapy［J］.Br J Cancer，2007，96(8):1293-1301.

［6］Chen Y，Shi L，Zhang L，et al.The molecular mechanism governing the oncogenic potential of Sox2 in breast cancer［J］.J Biol Chem，2008，283(26):17969-17978.

［7］Bass AJ，Watanabe H，Mermel CH，et al.Sox2 is an amplified lineage-survival oncogene in lung and esophageal squamous cell carcinomas［J］.Nat Genet，2009，41(11):1238-1242.

［8］Sanada Y，Yoshida K，Ohara M，et al.Histopathologic evaluation of stepwise progression of pancreatic carcinoma with immunohistochemical analysis of gastric epithelial transcription factor Sox2:comparison of expression patterns between invasive components and cancerous or nonneoplastic intraductal components［J］.Pancreas，2006，32(2):164-170.

［9］Hussenet T，Dali S，Exinger J，et al.Sox2 is an oncogene activated by recurrent 3q26.3 amplifications in human lung squamous cell carcinomas［J］.PLoS One，2010，5(1):e8960.

［10］Otsubo T，Akiyama Y，Yanagihara K，Yuasa Y.Sox2 is frequently downregulated in gastric cancers and inhibits cell growth through cellcycle arrest and apoptosis［J］.Br J Cancer，2008，98(4):824-931.

［11］Nichols J，Zevnik B，Anastassiadis K，et al.Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the Pou transcription factor Oct4［J］.Cell，1998，95(3):379-391.

［12］Wang X，Dai J.Concise review:isoforms of Oct4 contribute to the confusing diversity in stem cell biology［J］.Stem Cells，2010，28 (5):885-893.

［13］Yuan F，Zhou W，Zou C，et al.Expression of Oct4 in Hcc and modulation to Wnt/beta-catenin and Tgf-beta signal pathways［J］.Mol Cell Biochem，2010，343(1-2):155-162.

［14］Huang PZ，Lu CL，Li BK，et al.Oct4 expression in hepatocellular carcinoma and its clinical significance［J］.Ai Zheng，2010，29 (1):111-116.

［15］Wang Q，He W，Lu C，et al.Oct3/4 and Sox2 are significantly associated with an unfavorable clinical outcome in human esophageal squamous cell carcinoma［J］.Anticancer Res，2009，29(4): 1233-1241.