劉 丹，王貴喜，連 瑜，賈 璐，張廣煒，宋瑞琪，張 佳，孫 量

(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭014010)

在腦卒中發(fā)病機(jī)制的探討中，人們已逐漸認(rèn)識(shí)到，遺傳因素在其發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的作用。研究顯示，連接蛋白(CX37)基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化形成和進(jìn)展、急性心肌梗死、冠心病發(fā)病密切相關(guān)［1～10］，而腦卒中也是在動(dòng)脈粥樣硬化基礎(chǔ)上形成和發(fā)展的，那么CX37基因多態(tài)性與腦卒中是否相關(guān)?因此，本研究擬從基因遺傳學(xué)角度入手，探討CX37基因I1297D多態(tài)性與缺血性腦卒中和出血性腦卒中的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年7月～2010年10月在我科連續(xù)住院的急性腦卒中患者348例作為腦卒中組，其中男217例、女131例，年齡(61.02± 12.47)歲，其中包括出血性卒中患者116例(腦出血組)和缺血性卒中患者232例(腦缺血組)。依據(jù)1990年我國(guó)腦血管病分類標(biāo)準(zhǔn)，又將腦缺血組分為腦梗死組115例、腦栓塞組31例、腔隙性腦梗死組(腔梗組)86例，均符合全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議通過(guò)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭顱CT或MRI檢查證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn):嚴(yán)重感染、惡性腫瘤、結(jié)締組織病以及1 a內(nèi)患組織損傷疾病如心肌梗死，重大外科手術(shù)、接受免疫抑制劑治療者及同時(shí)患缺血性腦卒中和出血性腦卒中者。同期選擇我院體檢中心的無(wú)腦卒中病史的體檢者235例作為對(duì)照組，其中男146例、女89例，年齡(60.86±9.92)歲。兩組年齡、性別相匹配，具有可比性。所有入組者知情同意，為包頭市長(zhǎng)住居民、漢族、彼此無(wú)親緣關(guān)系。

1.2 調(diào)查和記錄方法 詳細(xì)詢問(wèn)并記錄入選者的一般情況(包括姓名、性別、年齡、職業(yè)、民族、住院號(hào)、地址、聯(lián)系電話等);既往情況(既往病史及健康狀況、吸煙飲酒史);住院情況(包括入院日期、入院NIHSS評(píng)分、GCS評(píng)分、實(shí)驗(yàn)室血液學(xué)檢驗(yàn)值、頭顱影像結(jié)果、出院日期、并發(fā)癥等);隨訪情況(生存狀況、復(fù)發(fā)、治療和康復(fù)情況以及預(yù)后評(píng)估量表Barthel Index)。

1.3 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析技術(shù)判定基因型 抽取患者晨空腹靜脈血2 mL，置EDTANa2抗凝管中-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂帽本┨旄狙夯蚪MDNA提取試劑盒提取DNA。采用PCR檢測(cè)，PCR引物序列參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，由上海生工合成。連接蛋白37基因I1297D基因擴(kuò)增引物序列為:上游引物5'-GGAGCCTCATTGCAAGTTGT-3'，下游引物5'-TGACTGTTCCATAGGGTGAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為214 bp;反應(yīng)體系為25 μL，其中模板DNA 100 ng，10×buffer 5 μL，dDNPs 1 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U和上下游引物各2 μL;反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，然后94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物(圖1)經(jīng)HinfⅠ限制性內(nèi)切酶與37℃消化過(guò)夜后，進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后分析基因型。

圖1 CX37 I1297D PCR產(chǎn)物電泳圖

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用s表示，用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算單個(gè)基因型和等位基因頻率，不同基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 與對(duì)照組比較，腦卒中組患者收縮壓、舒張壓和甘油三酯水平明顯升高(P＜0.05)，有吸煙史比例明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 腦卒中組和對(duì)照組一般資料比較

2.2 基因型鑒定 CX37 I1297D的DD型不含酶切位點(diǎn)的AG缺失型酶切產(chǎn)物為214 bp;II型含有酶切位點(diǎn)的AG純合型，酶切產(chǎn)物為111 bp和103 bp;ID型為雜合型，酶切產(chǎn)物為214 bp、111 bp、103 bp。由于酶切后產(chǎn)生的111 bp合103 bp兩條帶相距較近，電泳結(jié)果顯示為一條帶(圖2)。

圖2 PCR-HinfⅠ酶切的CX37 I1297D

2.3 不同腦卒中類型與對(duì)照組基因型和等位基因頻率比較 腦卒中組和對(duì)照組人群CX37 I1297D多態(tài)性基因型分布均處于Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05)，具有群體代表性。兩組人群CX37 I1297D基因型都出現(xiàn)三種，分別為II、ID、DD型，以II型為主。CX37基因I1297D的基因型和等位基因頻率分布在腦出血組、腦缺血組及其各亞組和對(duì)照組之間比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

3 討論

組成縫隙連接的蛋白亞單位稱為縫隙連接蛋白，本質(zhì)為一組蛋白質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20種以上。通過(guò)連接蛋白，相鄰細(xì)胞間可以形成細(xì)胞間通道，即縫隙連接［11］。相鄰細(xì)胞通過(guò)間隙連接進(jìn)行信息和物質(zhì)能量的交換，對(duì)于細(xì)胞的新陳代謝及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等生理過(guò)程起著重要調(diào)控作用。一些連接蛋白廣泛表達(dá)于各組織中，而另一些則較為嚴(yán)格地表達(dá)于特定組織中，并在那里發(fā)揮重要作用。CX37就屬于后者，被發(fā)現(xiàn)在脈管系統(tǒng)(如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞)和炎癥細(xì)胞中(如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)。近年研究發(fā)現(xiàn)CX37在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中具有一定意義;在腦缺血損傷研究中，急性腦缺血后縫隙連接活動(dòng)增強(qiáng)并參與腦缺血損傷，預(yù)先給予連接蛋白阻斷劑后，平均梗死面積較對(duì)照組明顯減少［12］;在蛛網(wǎng)膜下腔出血的模型研究中發(fā)現(xiàn)連接蛋白的表達(dá)水平上調(diào)與腦血管痙攣程度呈正相關(guān)［13］。CX37基因位于人類染色體1p35.1，全長(zhǎng)2 727 bp，由兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，編碼333個(gè)氨基酸。大量研究發(fā)現(xiàn)CX37基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈粥樣硬化形成、急性心肌梗死、冠心病發(fā)病有關(guān)。所有這些研究表明連接蛋白參與了多種心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展，并在其中起到了重要的作用。但關(guān)于CX37基因多態(tài)性與腦血管病的研究未見(jiàn)報(bào)道。

表2 不同腦卒中類型與對(duì)照組CX37 I1297D的基因型和等位基因頻率比較［例(%)］

本研究采用RFLP分析技術(shù)檢測(cè)我國(guó)北方漢族人群CX37基因I1297D多態(tài)的分布并進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國(guó)北方漢族人群在該位點(diǎn)存在著AG堿基的插入/缺失多態(tài)性，CX37基因I1297D多態(tài)性分布以II型為主，DD基因型和D等位基因?yàn)樯僖?jiàn)型。I1297D基因型和等位基因分布頻率在腦出血組、腦缺血組和對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而且，在缺血性腦卒中各亞組和對(duì)照組間亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明中國(guó)北方漢族人群的CX37 I1297D位點(diǎn)與腦卒中的發(fā)生無(wú)明顯相關(guān)性，提示CX37 I1297D多態(tài)性可能不是中國(guó)北方漢人群腦卒中發(fā)病的易感因素。另外，本研究中腦卒中組有吸煙史者比例及SBP、DBP、TG水平高于對(duì)照組，這與關(guān)于腦卒中發(fā)病機(jī)制及危險(xiǎn)因素的大部分研究結(jié)果相符。

腦梗死發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是獲得性危險(xiǎn)因素如生活方式、高血脂、高血壓、糖尿病等和種族、地域、環(huán)境、遺傳性危險(xiǎn)因素如基因多態(tài)性等共同相互作用所致。我們的研究為腦卒中的分子和群體遺傳學(xué)研究提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床防治心腦血管疾病開(kāi)辟了新的思路。

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