王冬冬，霍乃晨，王曉黎，張淑蘭

(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽110004;2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

宮頸癌發(fā)病率在女性惡性腫瘤中占第2位［1］。常規(guī)的治療方法是手術(shù)或者放療，以及手術(shù)和放療相結(jié)合的綜合治療。另外，許多醫(yī)療機(jī)構(gòu)將對(duì)根治術(shù)后患者實(shí)行新輔助化療作為常規(guī)治療［2］。但仍有相當(dāng)一部分患者存在術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，尋求手術(shù)、放療、化療之外的基因靶向治療和免疫治療方法是目前探索宮頸癌治療方法的新方向。IDO是色氨酸經(jīng)由犬尿氨酸代謝途徑中第一步中的限速酶，IDO過度表達(dá)可導(dǎo)致色氨酸缺乏和其代謝產(chǎn)物蓄積。色氨酸缺乏可使細(xì)胞毒T細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量減少［3］，色氨酸代謝產(chǎn)物蓄積可使NK細(xì)胞殺傷功能減弱［4］，從而產(chǎn)生腫瘤免疫耐受。腫瘤免疫耐受和宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究通過IDO基因轉(zhuǎn)染至宮頸癌細(xì)胞SiHa，研究IDO在體外對(duì)NK細(xì)胞的殺傷作用的影響，從而證明了IDO可以作為宮頸癌基因治療的潛在新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 宮頸癌細(xì)胞株SiHa培養(yǎng)于含10%的小牛血清、100 IU/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。

1.2 基因轉(zhuǎn)染 用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣沉淀方法將IDO基因表達(dá)載體pcDNA3.1-IDO［5］和空白對(duì)照載體pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞SiHa，經(jīng)抗生素篩選后得到IDO穩(wěn)定表達(dá)的Si-Ha/IDO細(xì)胞株和SiHa/Mock對(duì)照細(xì)胞株。

1.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的IDO蛋白表達(dá)測(cè)定 選擇耐藥克隆株應(yīng)用Western blot檢測(cè)IDO和內(nèi)參β-actin蛋白表達(dá)。待3種細(xì)胞(SiHa，SiHa/Mock和SiHa/IDO)的細(xì)胞匯合度達(dá)到95%時(shí)，收集細(xì)胞，NP-40裂解液裂解后，離心后取上清，檢測(cè)蛋白濃度(BioRad protein assay kit，Veemendaal，the Netherlands)，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。1%脫脂奶粉封閉1 h，抗人IDO抗體(TBST溶液1∶1 000稀釋)孵育過夜，TBST沖洗3次，二抗(TBST溶液1∶1 000稀釋)孵育1 h，TBST沖洗3次后，曝光顯影。PVDF膜經(jīng)蛋白剝離液洗脫后，1%脫脂奶粉封閉，用抗β-actin抗體重復(fù)上述步驟。

1.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定 應(yīng)用MTT試劑盒，每孔100個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL，將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37℃培養(yǎng)，每24 h在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 在體外腫瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷作用敏感性的檢測(cè) 用MTT試劑盒檢測(cè)體外腫瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷作用的敏感性。將3種腫瘤細(xì)胞(SiHa、SiHa/Mock和SiHa/IDO)500個(gè)分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同時(shí)加入KHYG-1細(xì)胞［6］(分別0、500、1 000、2 000個(gè))，在含有10%小牛血清的DMEM/ F12培養(yǎng)基中37℃共同培養(yǎng)72 h。PBS沖洗培養(yǎng)板3次，徹底清除KHYG-1細(xì)胞，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，以效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比值(E/T)為橫軸，光吸收值為縱軸繪制存活細(xì)胞的百分比變化曲線。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以s表示，組間比較采用組間Student’s t檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IDO蛋白表達(dá) IDO蛋白在SiHa/IDO細(xì)胞中表達(dá)陽性，在SiHa和SiHa/Mock細(xì)胞中無表達(dá)，見圖1。

2.2 腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)曲線測(cè)定 3組腫瘤細(xì)胞(SiHa、SiHa/Mock和SiHa/IDO)在體外生長(zhǎng)速度無明顯差異(P＞0.05)，見圖2。

2.3 體外腫瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷作用敏感性的檢測(cè) 見圖3。SiHa/IDO細(xì)胞存活的百分比高于其他兩組對(duì)照(SiHa和SiHa/Mock)細(xì)胞，P＜0.05。

圖3 腫瘤細(xì)胞和NK細(xì)胞共同培養(yǎng)后存活細(xì)胞的百分比變化曲線

3 討論

IDO是細(xì)胞內(nèi)一種含亞鐵血紅素的酶，廣泛分布于人和其他哺乳動(dòng)物除肝臟以外的其他組織中，是肝臟以外惟一可催化色氨酸經(jīng)由犬尿氨酸途徑進(jìn)行分解代謝的限速酶，可以將色氨酸分解為L(zhǎng)-犬尿酸、吡啶甲酸和喹啉酸等多種代謝物。正常情況下IDO在體內(nèi)呈低水平表達(dá)。由于色氨酸是細(xì)胞維持活化和增殖所必需的氨基酸，同時(shí)也是構(gòu)成蛋白質(zhì)必不可缺的重要成分，它的存在對(duì)各種細(xì)胞維持其正常功能非常關(guān)鍵。如果IDO的活性表達(dá)異常增高，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞微環(huán)境中色氨酸的耗竭，細(xì)胞便會(huì)失去正常的功能，生長(zhǎng)緩慢甚至凋亡。T細(xì)胞和NK細(xì)胞對(duì)此尤其敏感，因此IDO升高所致的色氨酸缺乏會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量減少［3］，色氨酸代謝產(chǎn)物的蓄積會(huì)通過抑制NK細(xì)胞受體的作用，從而抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞殺傷作用［4］，由此產(chǎn)生腫瘤的免疫抑制。Uyttenhove等［7］首次報(bào)道了IDO在人腫瘤組織中有表達(dá)，其中包括:前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌等，婦科腫瘤中，IDO在宮頸癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌組織中均有表達(dá)。有研究報(bào)道IDO可作為宮頸癌判斷預(yù)后的指標(biāo)［8］。

本研究應(yīng)用IDO基因表達(dá)載體pcDNA3.1-IDO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞SiHa，獲得了IDO高表達(dá)宮頸癌細(xì)胞SiHa/IDO。體外細(xì)胞增長(zhǎng)曲線顯示，高表達(dá)的IDO對(duì)宮頸癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)速度未產(chǎn)生影響。而體外腫瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷作用敏感性檢測(cè)結(jié)果提示SiHa/IDO細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷作用的敏感性低于其他兩組對(duì)照腫瘤細(xì)胞(SiHa和 SiHa/ Mock)，證實(shí)了IDO升高所致的色氨酸代謝產(chǎn)物的蓄積抑制了NK細(xì)胞的殺傷作用。另一方面，血管生成作用也是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要因素，但目前為止，關(guān)于IDO與血管生成作用關(guān)系的研究還十分有限。因此，進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)觀察IDO對(duì)于血管生成，比如說腫瘤內(nèi)新生血管數(shù)量的對(duì)比十分必要。

綜上，本研究通過體外試驗(yàn)證明了IDO參與了宮頸癌的生長(zhǎng)進(jìn)程，過表達(dá)IDO可以抑制NK細(xì)胞的殺傷作用，并可以此作為一個(gè)理論基礎(chǔ)進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)，研究這一宮頸癌基因治療的潛在新靶點(diǎn)。

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