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        胃癌細胞株SGC-7901和MGC-803的細胞周期分布及侵襲能力之比較研究▲

        2012-03-07 10:29:02馬鵬飛陳俊強劉金祿
        微創(chuàng)醫(yī)學(xué) 2012年3期
        關(guān)鍵詞:基底膜小室細胞株

        馬鵬飛 陳俊強 劉金祿 王 震

        (廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科,南寧市 530021)

        胃癌(Gastric cancer,GC)是全球最常見的惡性腫瘤之一,超過70%的新發(fā)和死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國家,其中又以東亞的發(fā)病率為最高[1~3]。臨床上對胃癌可采取手術(shù)、放療、化療等綜合治療措施,但仍有相當(dāng)數(shù)量的患者最終死于癌灶的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前認(rèn)為胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是多步驟、多因素、多基因參與的復(fù)雜過程,但具體機制仍不清楚。而腫瘤的惡性程度與其細胞的生物學(xué)特性密切相關(guān),故對不同來源、不同分化程度的胃癌細胞株進行研究,對研究胃癌的病因、發(fā)病機制及診斷治療大有裨益。本研究選取兩種常見的不同來源、不同分化程度的胃癌細胞株SGC-7901和MGC-803,通過流式細胞術(shù)檢測這兩株細胞的周期分布情況,并應(yīng)用Matrigel膠模仿人體細胞基底膜,通過計數(shù)穿過Transwell小室的相對細胞數(shù)目比較這兩種細胞株侵襲能力的差異,為體外深入研究胃癌細胞的增殖和侵襲能力奠定基礎(chǔ)。

        1 材料和方法

        1.1 材料與試劑 SGC-7901和MGC-803購自中國科學(xué)院上海細胞庫,DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自美國HyClone公司,細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基公司,纖維粘連蛋白(fibronectin,F(xiàn)N)購自美國Solarbio公司,基底膠(Matrigel膠)購自美國BD公司,結(jié)晶紫購自美國Sigma公司,Transwell小室購自美國CORNING公司。

        1.2 方法

        1.2.1 培養(yǎng)條件和方法 將SGC-7901和MGC-803培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,37℃、5%CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

        1.2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布 胰酶消化并收集細胞,PBS洗滌細胞一次(2 000 rpm離心,5 min),收集并調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL,制備的單細胞懸液用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇固定,4℃過夜,用PBS洗去固定液,加入100 μL RNAaseA,37℃水浴30 min,再加入400 μL熒光染料(PI)染色混勻,4℃避光30 min,流式細胞儀檢測,激發(fā)波長為488 nm,用620 nm波長濾器檢測紅色熒光,收集數(shù)據(jù)待分析。用MultiCycle分析軟件進行細胞周期的分析,分別計算G0/G1期、S期和G2/M期的相對比例。

        1.2.3 細胞侵襲實驗 用50 μL含5 μg纖維粘連蛋白的PBS處理Transwell小室聚碳酸酯膜的下表面。室溫下過夜干燥,Matrigel膠用冷的不含血清的 DMEM稀釋成1.25 mg/mL。分別取50 μL涂抹在小室基底膜的上表面,使上表面完全被覆蓋。然后37℃孵育4~5 h形成膠狀,將細胞用無血清的DMEM洗3遍。消化后重懸于含0.5%胎牛血清的 DMEM 中。調(diào)整細胞濃度(均為3.0×105個/mL)。用溫暖的無血清的DMEM水化膠狀的Matrigel膠,將100 μL單細胞懸液加入上室,將500 μL含5%胎牛血清的DMEM加入下室,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室,吸凈培養(yǎng)液,用棉簽擦去上室內(nèi)的細胞;小室基底膜用甲醛固定20 min,PBS沖洗,用結(jié)晶紫染色30 min。光鏡下觀察。隨機選取5個視野計數(shù)細胞個數(shù),取其平均值。通過計數(shù)侵襲細胞的數(shù)目來表示腫瘤細胞的侵襲能力,實驗重復(fù)三次。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析,以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”(±s)表示,采用兩樣本均數(shù)比較,t檢驗,檢驗水平為P<0.05。

        2 結(jié)果

        2.1 流式細胞術(shù)檢測胃癌細胞的周期分布 SGC-7901在G0/G1期、G2/M 期、S期的分布百分比分別為(63.74±3.40)%、(30.23±2.70)%、(6.03±0.70)%,見圖1;MGC-803在G0/G1期、G2/M期、S期的分布百分比分別為 (62.94±6.13)%、(28.67±7.76)%、(8.39±1.69)%,見圖2;兩胃癌細胞株對應(yīng)的周期時相分布百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖3。

        圖1 SGC-7901細胞周期分布圖

        圖2 MGC-803細胞周期分布圖

        圖3 SGC-7901和MGC-803細胞周期分布的比較(**P>0.05)

        2.2 Transwell小室檢測兩胃癌細胞株的侵襲能力 SGC-7901和MGC-803穿過涂抹有Matrigel膠的聚碳酸酯膜的細胞數(shù)分別為65.67±6.03(見圖4)和94.5±3.68(見圖5),后者是前者的1.44倍,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖6。

        圖4 SGC-7901侵襲實驗中穿越基底膜的細胞

        圖5 MGC-803侵襲實驗中穿越基底膜的細胞

        圖6 SGC-7901和MGC-803侵襲細胞數(shù)目的比較(*P<0.05)

        3 討論

        胃癌是一種病死率極高的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計,在各種癌癥致死因素中,胃癌排在第二位[4]。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是影響胃癌療效的主要因素,但具體機制尚不清楚[5]。而腫瘤的惡性程度與其細胞的生物學(xué)特性密切相關(guān),惡性程度越高的胃癌細胞株體外侵襲能力越強;反之,惡性程度低的胃癌細胞株體外侵襲能力則越弱。因此在體外對不同來源、不同分化程度的胃癌細胞株進行研究,可為胃癌的病因、發(fā)病機制及診斷治療的研究奠定基礎(chǔ)。

        本研究選取的兩種胃癌細胞中,MGC-803來源于低分化胃黏液腺癌細胞[6],SGC-7901來源于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃腺癌[7]。我們應(yīng)用流式細胞術(shù)比較兩種細胞株的周期分布情況,結(jié)果顯示這兩種胃癌細胞株對應(yīng)的周期時相分布百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。流式細胞術(shù)是利用細胞內(nèi)DNA能夠和熒光染料(PI)結(jié)合的特性,通過流式細胞儀對細胞內(nèi)DNA的相對含量進行測定,而細胞內(nèi)的DNA含量隨細胞周期進程發(fā)生周期性變化,故對DNA周期檢測可用來反映細胞周期的各個期的分布狀況,即細胞增殖情況。也就是說,如果僅僅從周期分布和統(tǒng)計學(xué)上來看,這兩種細胞株的增殖能力是一樣的,但考慮到胃癌細胞的增殖是一個多種因素相互影響的復(fù)雜過程,其相關(guān)原因及具體機制尚需進一步研究。

        Matrigel基質(zhì)是一種從Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠惡性腫瘤基膜分離的再生基膜,類似人體細胞基底膜,主要成分是層黏蛋白、Ⅳ型膠原和蛋白糖苷、肝素、硫酸鹽等成分。在體外侵襲實驗中,將Matrigel膠涂抹在Transwell小室基底膜的上表面,細胞只有將該層降解后才能進入下面的含高營養(yǎng)細胞培養(yǎng)液中。一般正常細胞無穿透能力,而腫瘤細胞則具有降解Matrigel膠的能力,侵襲性越強,穿越該層的能力就越強。本實驗中,我們將Transwell小室中分別種植不同的胃癌細胞,通過檢測穿越小室基底膜相對細胞數(shù)量來反映兩組胃癌細胞侵襲能力的差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn),MGC-803穿過涂抹有Matrigel膠的聚碳酸酯膜的細胞數(shù)(94.5±3.68)是SGC-7901(65.67±6.03)的1.44倍,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明MGC-803的侵襲能力強于SGC-7901。王玉巧等[8]在研究胃癌的遷移實驗中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象,但我們的實驗是用Matrigel膠模擬人的基底膜,更能接近人體的生理功能。這為進一步研究不同胃癌細胞株的侵襲機制奠定了堅實的基礎(chǔ)。

        [1] Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

        [2] Nishiyama M.Chemotherapy for gastric cancer in Japan[J].Int J Clin Oncol,2008,13(3):191-192.

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        [6] 林超鴻,富志民,劉亞倫,等.人體胃癌細胞株SGC-7901的建立[J].腫瘤,1981,2(1):1-3.

        [7] 王凱華.人體胃低分化粘液癌細胞系的建立及其生物學(xué)特性的初步觀察[J].實驗生物學(xué)報,1983,16(5):257-262.

        [8] 王玉巧,韓 梅,侯曉麗.四種人胃癌細胞體外增殖和侵襲能力比較[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志,2006,5(10):1486-1489.

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