馬鵬飛 陳俊強 劉金祿 王 震

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科，南寧市 530021)

胃癌(Gastric cancer，GC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，超過70%的新發(fā)和死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國家，其中又以東亞的發(fā)病率為最高［1～3］。臨床上對胃癌可采取手術(shù)、放療、化療等綜合治療措施，但仍有相當(dāng)數(shù)量的患者最終死于癌灶的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前認(rèn)為胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是多步驟、多因素、多基因參與的復(fù)雜過程，但具體機制仍不清楚。而腫瘤的惡性程度與其細胞的生物學(xué)特性密切相關(guān)，故對不同來源、不同分化程度的胃癌細胞株進行研究，對研究胃癌的病因、發(fā)病機制及診斷治療大有裨益。本研究選取兩種常見的不同來源、不同分化程度的胃癌細胞株SGC-7901和MGC-803，通過流式細胞術(shù)檢測這兩株細胞的周期分布情況，并應(yīng)用Matrigel膠模仿人體細胞基底膜，通過計數(shù)穿過Transwell小室的相對細胞數(shù)目比較這兩種細胞株侵襲能力的差異，為體外深入研究胃癌細胞的增殖和侵襲能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 SGC-7901和MGC-803購自中國科學(xué)院上海細胞庫，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自美國HyClone公司，細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基公司，纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)購自美國Solarbio公司，基底膠(Matrigel膠)購自美國BD公司，結(jié)晶紫購自美國Sigma公司，Transwell小室購自美國CORNING公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件和方法 將SGC-7901和MGC-803培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布 胰酶消化并收集細胞，PBS洗滌細胞一次(2 000 rpm離心，5 min)，收集并調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，制備的單細胞懸液用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇固定，4℃過夜，用PBS洗去固定液，加入100 μL RNAaseA，37℃水浴30 min，再加入400 μL熒光染料(PI)染色混勻，4℃避光30 min，流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，用620 nm波長濾器檢測紅色熒光，收集數(shù)據(jù)待分析。用MultiCycle分析軟件進行細胞周期的分析，分別計算G0/G1期、S期和G2/M期的相對比例。

1.2.3 細胞侵襲實驗 用50 μL含5 μg纖維粘連蛋白的PBS處理Transwell小室聚碳酸酯膜的下表面。室溫下過夜干燥，Matrigel膠用冷的不含血清的 DMEM稀釋成1.25 mg/mL。分別取50 μL涂抹在小室基底膜的上表面，使上表面完全被覆蓋。然后37℃孵育4～5 h形成膠狀，將細胞用無血清的DMEM洗3遍。消化后重懸于含0.5%胎牛血清的 DMEM 中。調(diào)整細胞濃度(均為3.0×105個/mL)。用溫暖的無血清的DMEM水化膠狀的Matrigel膠，將100 μL單細胞懸液加入上室，將500 μL含5%胎牛血清的DMEM加入下室，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室，吸凈培養(yǎng)液，用棉簽擦去上室內(nèi)的細胞;小室基底膜用甲醛固定20 min，PBS沖洗，用結(jié)晶紫染色30 min。光鏡下觀察。隨機選取5個視野計數(shù)細胞個數(shù)，取其平均值。通過計數(shù)侵襲細胞的數(shù)目來表示腫瘤細胞的侵襲能力，實驗重復(fù)三次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”(±s)表示，采用兩樣本均數(shù)比較，t檢驗，檢驗水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞術(shù)檢測胃癌細胞的周期分布 SGC-7901在G0/G1期、G2/M 期、S期的分布百分比分別為(63.74±3.40)%、(30.23±2.70)%、(6.03±0.70)%，見圖1;MGC-803在G0/G1期、G2/M期、S期的分布百分比分別為 (62.94±6.13)%、(28.67±7.76)%、(8.39±1.69)%，見圖2;兩胃癌細胞株對應(yīng)的周期時相分布百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖3。

圖1 SGC-7901細胞周期分布圖

圖2 MGC-803細胞周期分布圖

圖3 SGC-7901和MGC-803細胞周期分布的比較(＊＊P＞0.05)

2.2 Transwell小室檢測兩胃癌細胞株的侵襲能力 SGC-7901和MGC-803穿過涂抹有Matrigel膠的聚碳酸酯膜的細胞數(shù)分別為65.67±6.03(見圖4)和94.5±3.68(見圖5)，后者是前者的1.44倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖6。

圖4 SGC-7901侵襲實驗中穿越基底膜的細胞

圖5 MGC-803侵襲實驗中穿越基底膜的細胞

圖6 SGC-7901和MGC-803侵襲細胞數(shù)目的比較(*P＜0.05)

3 討論

胃癌是一種病死率極高的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，在各種癌癥致死因素中，胃癌排在第二位［4］。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是影響胃癌療效的主要因素，但具體機制尚不清楚［5］。而腫瘤的惡性程度與其細胞的生物學(xué)特性密切相關(guān)，惡性程度越高的胃癌細胞株體外侵襲能力越強;反之，惡性程度低的胃癌細胞株體外侵襲能力則越弱。因此在體外對不同來源、不同分化程度的胃癌細胞株進行研究，可為胃癌的病因、發(fā)病機制及診斷治療的研究奠定基礎(chǔ)。

本研究選取的兩種胃癌細胞中，MGC-803來源于低分化胃黏液腺癌細胞［6］，SGC-7901來源于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃腺癌［7］。我們應(yīng)用流式細胞術(shù)比較兩種細胞株的周期分布情況，結(jié)果顯示這兩種胃癌細胞株對應(yīng)的周期時相分布百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。流式細胞術(shù)是利用細胞內(nèi)DNA能夠和熒光染料(PI)結(jié)合的特性，通過流式細胞儀對細胞內(nèi)DNA的相對含量進行測定，而細胞內(nèi)的DNA含量隨細胞周期進程發(fā)生周期性變化，故對DNA周期檢測可用來反映細胞周期的各個期的分布狀況，即細胞增殖情況。也就是說，如果僅僅從周期分布和統(tǒng)計學(xué)上來看，這兩種細胞株的增殖能力是一樣的，但考慮到胃癌細胞的增殖是一個多種因素相互影響的復(fù)雜過程，其相關(guān)原因及具體機制尚需進一步研究。

Matrigel基質(zhì)是一種從Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠惡性腫瘤基膜分離的再生基膜，類似人體細胞基底膜，主要成分是層黏蛋白、Ⅳ型膠原和蛋白糖苷、肝素、硫酸鹽等成分。在體外侵襲實驗中，將Matrigel膠涂抹在Transwell小室基底膜的上表面，細胞只有將該層降解后才能進入下面的含高營養(yǎng)細胞培養(yǎng)液中。一般正常細胞無穿透能力，而腫瘤細胞則具有降解Matrigel膠的能力，侵襲性越強，穿越該層的能力就越強。本實驗中，我們將Transwell小室中分別種植不同的胃癌細胞，通過檢測穿越小室基底膜相對細胞數(shù)量來反映兩組胃癌細胞侵襲能力的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MGC-803穿過涂抹有Matrigel膠的聚碳酸酯膜的細胞數(shù)(94.5±3.68)是SGC-7901(65.67±6.03)的1.44倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明MGC-803的侵襲能力強于SGC-7901。王玉巧等［8］在研究胃癌的遷移實驗中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，但我們的實驗是用Matrigel膠模擬人的基底膜，更能接近人體的生理功能。這為進一步研究不同胃癌細胞株的侵襲機制奠定了堅實的基礎(chǔ)。

［1］ Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2):69－90.

［2］ Nishiyama M.Chemotherapy for gastric cancer in Japan［J］.Int J Clin Oncol，2008，13(3):191－192.

［3］ Brenner H，Rothenbacher D，Arndt V.Epidemiology of stomach cancer［J］.Methods Mol Biol，2009，472:467－477.

［4］ Brenner B，Hoshen MB，Purim O，et al.MicroRNAs as a potential prognostic factor in gastric cancer［J］.World J Gastroenterol，2011，17(35):3976－3985.

［5］ Kim HJ，Eun JY，Jeon YW，et al.Efficacy and safety of oxaliplatin，5-fluorouracil，and folinic acid combination chemotherapy as first-line treatment in metastatic or recurrent gastric cancer［J］.Cancer Res Treat，2011，43(3):154－159.

［6］ 林超鴻，富志民，劉亞倫，等.人體胃癌細胞株SGC-7901的建立［J］.腫瘤，1981，2(1):1－3.

［7］ 王凱華.人體胃低分化粘液癌細胞系的建立及其生物學(xué)特性的初步觀察［J］.實驗生物學(xué)報，1983，16(5):257－262.

［8］ 王玉巧，韓 梅，侯曉麗.四種人胃癌細胞體外增殖和侵襲能力比較［J］.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2006，5(10):1486－1489.