白吉慶，王小平，盛 艷，李雙俊

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046; 2.陜西省洛南縣科學(xué)技術(shù)局，陜西 商洛 726100)

九節(jié)菖蒲為毛茛科植物阿爾泰銀蓮花 Anemone altaica Fisch.ext C.A.Mey.的干燥根莖，又名節(jié)菖蒲、小菖蒲、京玄參、菊形雙瓶梅等，具有開竅化痰、醒脾安神功效，主要用于熱病神昏、癲癇、神經(jīng)官能癥、耳鳴耳[1]，主產(chǎn)于河南、山西、陜西、甘肅和內(nèi)蒙古等地[2－3]。九節(jié)菖蒲在《藥物出產(chǎn)辨》和《中國(guó)藥物標(biāo)本圖影》中均被視為石菖蒲的偽品，而在1963年版和1977年版《中國(guó)藥典(一部)》以及《中藥材手冊(cè)》《中藥大辭典》《中藥志》等均以正品收載[3]。九節(jié)菖蒲主要含有琥珀酸、棕櫚酸、5－羥基－4－氧化戊酸、β－谷甾醇、銀蓮花素(白頭翁素)、蔗糖、皂苷[4－6]等。筆者建立了九節(jié)菖蒲中總皂苷、腺苷和齊墩果酸的含量測(cè)定方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

UV－2100型紫外－可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司);日立L－2400型高效液相色譜儀(UV檢測(cè)器、L－2130泵、EZStant色譜工作站);Sartorius電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，精度0.01mg);SB－3200D型超聲儀(上海新芝生物技術(shù)研究所)等。齊墩果酸對(duì)照品(批號(hào)為110709－200304)、腺苷對(duì)照品(批號(hào)為110879－200202)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;九節(jié)菖蒲經(jīng)鑒定為毛茛科銀蓮花屬植物阿爾泰銀蓮花 Anemone altaica Fisch.ext C.A.May.的根莖，流動(dòng)相所用乙腈為色譜純，甲醇、乙醇等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

齊墩果酸:色譜柱為 Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈－水(92 ∶8);流速為 1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為208 nm;柱溫為室溫;進(jìn)樣量為10 μL。腺苷:色譜柱為Diamonsil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈－水(8 ∶92);流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm;柱溫為室溫;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取干燥至恒重的腺苷對(duì)照品適量，加甲醇使溶解，制成每1 mL含腺苷0.034 mg的腺苷對(duì)照品溶液。精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸對(duì)照品適量，加流動(dòng)相使溶解，制成每1 mL含齊墩果酸0.045 mg的齊墩果酸對(duì)照品溶液。取九節(jié)菖蒲粉末1 g，精密稱定，置100 mL燒瓶中，加100 mL 95%乙醇，回流1 h，過(guò)濾，濾液水浴揮干，殘?jiān)眉状既芤?，? mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液A(用于腺苷、齊墩果酸含量測(cè)定)。取九節(jié)菖蒲粉末0.5 g，精密稱定，置100 mL燒瓶中，加40 mL 95%乙醇，回流1 h，過(guò)濾，濾液置50 mL容量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻，精密吸取適量，置10 mL量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液B(用于總皂苷含量測(cè)定)。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察[7]:精密稱取齊墩果酸對(duì)照品適量，加95%乙醇制成每 1 mL 含 2 mg 的溶液。精密吸取該溶液 0，0.8，1.6，2.4，3.2，4 mL，置具塞試管中，依次加入新配制的80 g/L香蘭素乙醇溶液0.5 mL，體積分?jǐn)?shù)為72%的硫酸溶液5 mL，搖勻，于90℃恒溫水浴上加熱10 min，立即取出并于冰水浴中冷卻15 min，取出，冷卻至室溫。以相應(yīng)試劑為空白，在530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度對(duì)質(zhì)量濃度線性回歸。精密吸取腺苷對(duì)照品溶液1.25，2.50，3.75，5.00，6.25 mL，分別置 10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，各取10 μL注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度線性回歸。精密吸取齊墩果酸對(duì)照品溶液 1.0，2.5，5.0，7.5，10.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，各取10 μL注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度線性回歸。得回歸方程 Y總=8.735 7 X+0.000 6(R2=0.999 3，Y腺=2e+08X+15 544(R2=0.999 9)，Y齊=2e+08X－19 604(R2=0.999 9)。

精密度試驗(yàn):精密吸取齊墩果酸(2 g/L)對(duì)照品溶液，依法測(cè)定其吸光度，連續(xù)測(cè)定5次，其吸光度的 SR為1.4%。分別精密吸取齊墩果酸(0.045 g/L)、腺苷(0.034 g/L)對(duì)照品溶液 10 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果齊墩果酸、腺苷峰面積的 RSD分別為0.4%和0.5%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，依法測(cè)定總皂苷含量，分別在 0，0.5，1，3，5 h 不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，其吸光度的 SR為1.7%，表明供試品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定。取同一供試品溶液10 μL，分別在 0，1，2，6，12 h注入液相色譜儀，測(cè)定腺苷的峰面積值，其含量的 RSD為0.6%，表明供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取同一供試品溶液 10 μL，分別在 0，1，2，5，10 h 注入液相色譜儀，測(cè)定齊墩果酸的峰面積值，其含量的 RSD為0.7%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重現(xiàn)性試驗(yàn):取同一樣品5份，依法制備供試品溶液，分別測(cè)定其吸光度，測(cè)定齊墩果酸、腺苷的峰面積值，其含量的 RSD分別為1.6%，0.4%，1.6%，表明本試驗(yàn)方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取已知總皂苷含量的樣品6份，精密加入一定量齊墩果酸對(duì)照品，依法測(cè)定其吸光度;精密稱取已知腺苷含量的樣品6份，精密加入一定量腺苷對(duì)照品，依法制備供試品溶液，取10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定腺苷的峰面積值;精密稱取已知齊墩果酸含量的樣品6份，精密加入一定量齊墩果酸對(duì)照品，依法制備供試品溶液，取10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定齊墩果酸的峰面積值，計(jì)算其回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測(cè)定

取九節(jié)菖蒲樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，顯色后，依法在530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄腺苷、齊墩果酸的峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算總皂苷、腺苷、齊墩果酸的含量。結(jié)果見表2。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

取適量對(duì)照品溶液和供試品溶液，置具塞試管中，依次加入新配制的80 g/L香蘭素乙醇溶液0.5 mL，體積分?jǐn)?shù)為72%的硫酸溶液5 mL，搖勻，于90℃恒溫水浴上加熱10 min，立即取出并于冰水浴中冷卻15 min，取出，冷卻至室溫。在400～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果在530 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選取530 nm波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)。取適量對(duì)照品和供試品溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果齊墩果酸在208 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，腺苷在260 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故分別以此作為其檢測(cè)波長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)多種流動(dòng)相的組成、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)采用2.1項(xiàng)下的色譜條件能使色譜圖的基線平直、峰形較好，且待測(cè)成分的分離度均大于1.5。

本研究中建立了九節(jié)菖蒲主要化學(xué)成分的高效液相色譜定量分析方法，方法專屬性強(qiáng)，定量精密度高，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，可為九節(jié)菖蒲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究奠定基礎(chǔ)。

對(duì)供試品溶液制備方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，回流提取法所得總皂苷、齊墩果酸、腺苷含量最高，超聲提取法最低，因此采用回流提取法處理樣品。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1978:13－14.

[2]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005:46－47.

[3]國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草(上冊(cè))[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1998:505－507.

[4]李婷婷，路 芳，楊秀東.九節(jié)營(yíng)蒲研究進(jìn)展[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22(3):68－69.

[5]鄒忠杰，楊峻山.九節(jié)營(yíng)蒲化學(xué)成分研究[J].中藥材，2008，31(1):49－51.

[6]肖輝軍.石營(yíng)蒲與九節(jié)營(yíng)蒲的鑒別使用[J].北京中醫(yī)藥，2011，30(1):56－57.

[7]魯湘鄂.崗梅根中總皂苷的提取工藝研究[J].中國(guó)藥業(yè)，2010，19(22):54－55.