臺蓮梅， 鄭寰宇， 左豫虎＊， 靳學慧， 金光輝

（1．黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，大慶 163319； 2．黑龍江省鶴崗市蘿北縣寶泉嶺農(nóng)場，154211）

馬鈴薯是黑龍江省的第4大作物，是我國重要的種薯及商品薯生產(chǎn)基地之一［1］。隨著種植業(yè)作物結(jié)構(gòu)的調(diào)整，目前馬鈴薯種植面積保持在42萬hm2左右，占全省糧食總面積的3．8%，占經(jīng)濟作物面積的21．3%［2］。隨著馬鈴薯種植面積的不斷擴大，馬鈴薯早疫病的發(fā)生逐漸成為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的嚴重威脅。如2008年－2009年早疫病危害嚴重，在個別地塊個別品種上早疫病發(fā)病率達到100%，因植株提早枯死而造成嚴重的經(jīng)濟損失。國內(nèi)外在誘導病菌產(chǎn)孢［3－4］、馬鈴薯抗性篩選［5］、田間病害防治［6－7］、抗性機制［8－9］等方面均有報道，而對馬鈴薯早疫病菌不同菌株的生物學特性研究未見報道。本文研究了分離自黑龍江馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的馬鈴薯早疫病菌菌株的生物學特性的遺傳多樣性，為進一步用分子生物學方法揭示馬鈴薯早疫病菌的遺傳多樣性，開展病菌致病性分化和病害的防治理論研究奠定基礎。研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1．1 供試菌株

2008年分別從黑龍江省不同馬鈴薯產(chǎn)區(qū)，采集馬鈴薯早疫病病葉，按常規(guī)組織分離法分離病原菌，經(jīng)單孢純化，獲得茄鏈格孢菌分離株68株，經(jīng)致病性驗證后，選取34株菌作為研究對象，菌株編號和采集地點見表1。

供試菌餅均采用25℃條件下、PDA上培養(yǎng)5 d的直徑為5 mm的等齡菌餅。

表1 馬鈴薯早疫病菌供試菌株及其采集地點

1．2 不同分離株在馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀

將接種不同分離株的PDA平板置25℃條件下暗培養(yǎng)，每個菌株3次重復，第3天開始測量菌落直徑，測到第7天。第9天觀察記錄菌落的顏色、形狀、氣生菌絲的疏密程度，菌落成帶現(xiàn)象，并記錄有無孢子形成。然后選擇在PDA培養(yǎng)基上菌落特征差異明顯的5個分離株，研究其生物學特性。

1．3 不同菌株在馬鈴薯葡萄糖（PD）培養(yǎng)液中的培養(yǎng)性狀

菌餅接種于PD培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)，7 d后觀察培養(yǎng)性狀，如培養(yǎng)液的澄清度、菌絲孢子球顏色及大小等。每個菌株3次重復。

1．4 培養(yǎng)基種類對不同菌株菌絲生長的影響

菌餅分別接種在PDA、馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基（PCA）、玉 米 粉 培 養(yǎng) 基 （CMA）［10］、燕 麥 培 養(yǎng) 基（OA）［10］平板中央，25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)，7 d后測量菌落直徑，每個處理4次重復。

1．5 培養(yǎng)條件對不同菌株菌絲生長的影響

1．5．1 溫度對不同菌株菌絲生長的影響

菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上，分別置于10、15、20、25、30、35℃條件下黑暗培養(yǎng)，7 d后測量菌落直徑，每個處理4次重復。

1．5．2 p H對不同菌株菌絲生長的影響

用濃度為1 mol／L的 HCl和1 mol／L Na OH配制p H 為4、5、6、7、8、9、10共7個梯度，將菌餅接種于PDA平板中央，25℃條件培養(yǎng)，7 d后測量菌落直徑，每個處理設4次重復。

1．5．3 光照條件對不同菌株菌絲生長的影響

將菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上，分別置于全黑暗、12 h光暗交替、全光照，25℃條件培養(yǎng)，7 d后測量菌落直徑，每個處理4次重復。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同分離株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀

2．1．1 生長速度

從表2可以看出，各分離株在PDA培養(yǎng)基上均能生長，但不同菌株的生長速率不同：SH0806菌株生長速度最快，其平均生長速率為1．52 c m／d；其次為NH0808、KS0801、SH0801菌株；生長速度較 慢 的 是 AD0701、SH0802、NH0809、JS0802、NH0803、SH0804、JG0801、HL0801、HL0808 菌株；根據(jù)各菌落生長速率差異的顯著性，可以將34株馬鈴薯早疫病菌分為2類：第1類，平均生長速率在1．19～1．6 c m／d，共有25株菌，第2類，平均生長速率在0．10～0．74 c m／d，共有9株菌。

2．1．2 生長形態(tài)

第9天的觀察結(jié)果（表2）表明：各分離株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征出現(xiàn)較大差異。多數(shù)菌株菌落為圓形，氣生菌絲灰色，菌絲生長均勻、稀疏、光滑，不產(chǎn)生分生孢子，但SH0806菌株的培養(yǎng)性狀與其他供試菌株差異明顯，氣生菌絲黑綠色，在PDA培養(yǎng)基上可產(chǎn)生大量的孢子；供試菌株在PDA培養(yǎng)基上可產(chǎn)生差異較大的色素：黑色、淡黃色、黃色、橘黃色、黑綠色；在PDA 培養(yǎng)基上，菌落HL0806、JG0802、KS0802呈放射帶，其他菌落均有同心帶。

根據(jù)PDA上的培養(yǎng)特征可將34個分離株分為5類：第1類，菌落正面為黑綠色，菌落生長快，菌落圓形，光滑無成帶現(xiàn)象，產(chǎn)生孢子，菌株有SH0806；第2類，菌落正面為灰色至灰黃色，菌落生長較快，菌落圓形，光滑或粗糙，有成帶現(xiàn)象，不產(chǎn)生孢子，菌株有SH0801、HL0804、HL0806、JG0802、JG0803、JG0805、JG0806、KS0801、KS0805、KS0807、KS0813、KS0819、NH0810、 HS0803、 NJ0801、 KS0802、 NH0805、NH0808、HS0801、DQ0803；第3類，菌落正面為灰色，菌絲生長較快，菌落圓形，光滑，無成帶現(xiàn)象，不產(chǎn)生孢子，菌株有 KS0808、KS0817、KS0823；第4類，菌落正面為灰色，菌落生長較快，菌落不規(guī)則，光滑，無成帶現(xiàn)象，不產(chǎn)生孢子，菌株有HL0802；第5類，菌絲生長較慢，菌落不規(guī)則或圓形、土丘狀，粗糙，無成帶現(xiàn)象，不產(chǎn)生孢子：SH0802、SH0804、HL0801、HL0808、JG0801、JS0802、NH0803、NH0809、AD0701。另外，同一地區(qū)存在不同培養(yǎng)性狀的菌株。

表2 馬鈴薯早疫病菌各菌株在PDA平板培養(yǎng)基上生長速率及培養(yǎng)特性1）

2．2 不同分離株在PD培養(yǎng)液中的培養(yǎng)性狀

從上述菌株中選取來源不同的5株馬鈴薯早疫病菌在PD培養(yǎng)液中培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)性狀，結(jié)果見表3。供試早疫病菌在PD培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)液澄清，菌絲球黑色，菌絲球表面著生黑色絨毛，密；只有菌株KS0808菌絲球為白色，菌球表面絨毛?。慌囵B(yǎng)液呈不同的顏色，這與該菌株產(chǎn)生色素有關。

表3 馬鈴薯早疫病菌各菌株在PD培養(yǎng)液中的培養(yǎng)特性

2．3 不同培養(yǎng)基對早疫病菌菌絲生長的影響

5個菌株在供試培養(yǎng)基上均能生長，但不同菌株在不同培養(yǎng)基上生長速度不同（圖1）。菌株SH0806、HS0801、KS0808最適宜在PDA培養(yǎng)基上生長，生長速度最快，在另3種培養(yǎng)基上的生長速度差異不大，均略低于PDA培養(yǎng)基；菌株NH0809、JG0801適宜在玉米粉培養(yǎng)基（CMA）上生長，而JG0801不適宜在馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基上生長。

圖1 培養(yǎng)基對早疫病菌菌絲生長的影響

2．4 不同溫度對早疫病菌菌絲生長的影響

各菌株在不同的溫度條件下培養(yǎng)，菌落直徑差異較大（圖2）。各菌株在10～35℃的條件下均能生長，但其生長的最適溫度有一定的差異。菌株SH0806生長最適溫度為20～30℃，HS0801、KS0808、JG0801生長最適溫度為25～30℃，NH0809生長的最適溫度為20℃。另外，培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，溫度高菌落顏色深，說明溫度對病菌產(chǎn)生色素有一定的影響。

2．5 p H對早疫病菌菌絲生長的影響

試驗結(jié)果見表4，在相同p H培養(yǎng)條件下，各菌株生長速度有差異；而同一菌株在不同的p H培養(yǎng)條件下，菌株生長也存在差異。各菌株在p H4～10的范圍內(nèi)均可生長，適宜的p H為6～8，菌株SH0806、HS0801、KS0808、JG0801在p H 7生長最快，而菌株NH0809在p H 6生長最快。

圖2 溫度對早疫病菌菌絲生長的影響

表4 p H對早疫病菌菌絲生長的影響

2．6 光照條件對菌絲生長的影響

研究結(jié)果表明（圖3），在同一時間內(nèi)，不同的光照培養(yǎng)，同一菌株菌落直徑有一定的差異，光照對各菌株菌絲生長有一定的促進作用。除了菌株JG0801以外的4個菌株，對光照條件的變化反應一致：在24 h全光照條件下，菌落擴展最快，光暗交替次之，而24 h全黑暗條件下，菌落生長得最慢。而菌株JG0801不同，在光暗交替下，菌絲生長速度最慢。光照有利于色素產(chǎn)生，全光照菌落顏色深于全黑暗。

圖3 光照對早疫病菌菌絲生長的影響

3 討論

Ku mar等［11］對來自印度的11個番茄早疫病菌（A．sol ani）菌株的培養(yǎng)形狀、形態(tài)學、致病性的研究結(jié)果表明，各菌株在PDA培養(yǎng)基上生長速度不同，不產(chǎn)生分生孢子，菌落圓形或不規(guī)則形，菌落有的呈同心帶，有的沒有成帶現(xiàn)象。本試驗對來自黑龍江省的34株馬鈴薯早疫病菌的培養(yǎng)特性的研究發(fā)現(xiàn)，不同菌株在PDA培養(yǎng)基上生長速度有明顯不同；各菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)也不同，多數(shù)為圓形，少數(shù)為不規(guī)則性，有的有成帶現(xiàn)象（同心帶或放射帶）；菌落正面顏色多為灰色，但菌落背面顏色差異很大，呈多種顏色，說明不同分離菌株可產(chǎn)生不同的色素。本試驗研究結(jié)果與Ku mar等［11］的結(jié)果有所不同，這可能是早疫病分離菌的寄主、地區(qū)來源不同等所致。不同菌株在PD培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液顏色，菌絲球的顏色、大小也表現(xiàn)出明顯的不同。同一菌株在固體和液體培養(yǎng)基中表現(xiàn)的色素顏色不完全一致，可能與培養(yǎng)方式不同有關，也說明不同培養(yǎng)條件可能影響馬鈴薯早疫病菌的一些生長代謝過程。

供試馬鈴薯早疫病菌5株菌中，菌株SH0806生長最適宜的溫度為20～30℃，HS0801、KS0808、JG0801生長的最適溫度為25～30℃，與童蘊慧等［12］報道番茄早疫病菌最適生長溫度為23～28℃，鄒慶道等［13］報道番茄早疫病菌的適宜溫度為23～30℃的結(jié)果有相似之處，但菌株NH0809生長的最適溫度為20℃，低于其他分離菌株和前人［12－13］的報道，可能是由于不同來源的菌株生長對溫度要求存在差異。馬鈴薯早疫病菌生長的適宜p H為6～8，這與童蘊慧等［12］、王連平等［14］人研究番茄早疫病菌的結(jié)果基本一致。光照有利于病菌菌絲的生長，菌株SH0806、HS0801、KS0808、JG0801在全光照生長最快，12 h光暗交替次之，全黑暗生長最慢，與鄒慶道等［13］試驗結(jié)果一致。而菌株JG0801不同，在光暗交替下，菌絲生長速度最慢。

本研究表明，馬鈴薯早疫病菌菌株間在生物學特性方面存在一定差異，但菌株的致病力是否有分化，及菌株是否存在生理分化現(xiàn)象，有待于進一步研究。

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