趙英子，張小明，房威，何麗娟，張震

學習記憶是大腦最基本也是最重要的高級神經(jīng)功能之一，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的整合，海馬與學習記憶的關系密切。眾多研究表明[1-2]，損毀雙側(cè)海馬動物的學習記憶能力明顯下降，對大鼠的分辨學習、防御、條件反應的保持及空間習得能力都有破壞。在學習記憶的神經(jīng)機制中，關于突觸的可塑性問題近來倍受關注。有較多文獻報道了與學習行為有關的長時程增強(long-term potentiation,LTP)樣突觸效應變化[3-4]。有報道齒狀回突觸效應與行為訓練的關系，發(fā)現(xiàn)動物出現(xiàn)與行為反應相對應的突觸效應增強。腦梗死常引起學習記憶障礙，行為訓練可明顯改善神經(jīng)功能。目前有關行為訓練促進腦梗死大鼠神經(jīng)功能的恢復主要集中在運動功能評定及學習記憶改善的行為研究，而由行為訓練引起腦梗死大鼠學習記憶改善的基礎——海馬CA3區(qū)習得性LTP的變化報道較少。本研究通過康復訓練對腦梗死大鼠學習記憶能力和海馬CA3區(qū)習得性LTP的影響，初步探討腦梗死后運動康復對中樞神經(jīng)系統(tǒng)尤其是對海馬神經(jīng)元的功能及突觸可塑性的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性清潔級SD大鼠30只，體重(210±10)g，8～9周齡，由本院實驗動物中心提供。隨機分為腦梗死自由活動組(模型組)、腦梗死康復訓練組(康復組)和正常組，每組各10只。

1.2 方法

1.2.1 雙側(cè)海馬梗死模型制作及電極埋植 大鼠用20 g/L戊巴比妥鈉按50 mg/kg常規(guī)麻醉后，將其俯臥于腦立體定位儀上，沿頭顱正中切開頭皮暴露顱骨。無菌條件下進行慢性電極埋植，切開頭皮，暴露左腦顱頂，用顱骨鉆于海馬、內(nèi)嗅區(qū)穿通纖維PP位置各鉆一小孔，記錄電極為絕緣金屬電極。直徑0.2 mm，用微電極推進器置于海馬CA3區(qū)錐體細胞層，按布瑞希圖譜并訂正，定位內(nèi)嗅區(qū)(Ap)3.0～3.4 mm，門齒鉤(L)3.3～3.5 mm，耳間線(H)3.8～4.2 mm。參考電極用小螺釘固定在顱骨上。做電極埋植術時，按定位參數(shù)上下移動記錄電極和刺激電極，選能記錄到最大群體峰電位(population spike,PS)的部位，然后用牙托粉固定[5]。

雙側(cè)海馬梗死模型制作方法：在前囟后4.8 mm、中線向左右旁開3.6 mm處，分別用牙科鉆輕輕鉆一個直徑約1 mm的骨窗，光纖管尾端至皮層下3.2 mm(海馬CA3)。注射虎紅70 mg/kg后，立即通過光纖管照射一側(cè)海馬組織。照射完畢時再補充原虎紅劑量的一半，然后立即進行另一側(cè)的冷光源照射，光照強度0.37 W/cm2，照射時間各30 min。術后縫合頭皮正常喂養(yǎng)。模型組關在籠中不給予任何訓練；康復組造模后休息4 d，于第5天開始康復訓練。

1.2.2 康復訓練

1.2.2.1 運動功能訓練 將大鼠放于長100 cm，直徑60 cm的圓形網(wǎng)狀儀中，手搖轉(zhuǎn)動，25 r/min，讓其被動跑籠；10 min后將大鼠放于長150 cm，寬2 cm的方木棒上以食物誘導其行走，訓練10 min，共訓練30 d。

1.2.2.2 學習記憶能力訓練 2周后采用劃分4個象限(按順時針方向定義為A、B、C、D)的自制直徑1.2 m，高0.5 m圓桶，盛水后按0.5%～1.5%的比例加入奶粉，使水成為不透明乳白色，水溫控制于22°～23°，將一直徑11 cm平臺固定于A象限，平臺在水面下1 cm。大鼠從另外3個象限隨機放入桶中，如3 min內(nèi)找不到平臺，則將其在平臺上放置15 s。每次訓練間隔5 min，每天3次，共訓練30 d。

1.3 行為學測試

1.3.1 Y-型迷宮 Y-型迷宮為一個三等臂式迷宮，每臂頂端設一信號燈，信號燈亮后6 s，此臂即為危險區(qū)，通以36 V交流電，刺激大鼠從所在的亮臂跑到暗臂。訓練中始終有一臂為安全區(qū)，安全區(qū)按無規(guī)則的次序變換。如果大鼠在通電后從所在亮臂跑到另一亮臂記為錯誤，跑到暗臂則為正確。一天內(nèi)連續(xù)分段訓練大鼠，每10次為一段，兩段間大鼠休息2 min。放入明室至進入暗室的時間稱作潛伏期(PS潛伏期)。記錄大鼠掌握迷宮結(jié)構(gòu)(連續(xù)10次測試中有9次正確即為掌握迷宮結(jié)構(gòu))所需的訓練次數(shù)。

1.3.2 被動回避反應 將多功能條件反應箱平放在60 cm高的桌邊，跳板完全懸空，將大鼠尾對門洞平放在跳板上，大鼠能很快找到門洞并進入反應箱。關閉門洞，并用適宜電壓電擊前爪5～10 s。如此反復3次，24 h后重復測定大鼠在跳板上停留的潛伏期，記為電擊后步入潛伏期，最長觀察時間為300 s，統(tǒng)計值采用中位數(shù)。凡達到300 s仍不進入反應箱者，計為300 s。

1.4 在體LTP記錄 行為學測試前及運動康復訓練、行為學測試完畢4 h后，讓動物在一自制小籠中處于安靜狀態(tài)，以刺激器和隔離器輸出頻率0.7 Hz、波寬0.1 ms的方波進行單刺激，強度相當于引起突觸反應和峰電位最大振幅50%，于CA3區(qū)錐體細胞層記錄LTP。誘發(fā)電位經(jīng)微電極放大器、SJ-F處理放大器振幅及A/D卡放大器三級放大后，用計算機采集處理和分析。計算PS增幅：

不同時間LTP的比較采用學習前后振幅增大的百分率。記錄60次學習后和學會后PS增幅，不到60次即學會的大鼠記錄60次學習后PS增幅。實驗結(jié)束后，對動物記錄電極、刺激電極做定位檢查，定位不準確者給予剔除。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 行為學測試 模型組掌握迷宮結(jié)構(gòu)所需訓練次數(shù)多于正常組和康復組(P<0.05)，正常組和康復組無顯著性差異(P>0.05)。被動回避反應中，模型組電擊后步入潛伏期短于正常組和康復組(P<0.05)，正常組和康復組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 三組學習記憶能力比較

2.2 PS增幅及PS潛伏期 60次Y-型迷宮訓練后，康復組PS增幅大于模型組(P<0.05)；而當康復組和模型組Y-型迷宮分辨學習達標后，PS增幅比較無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

Y-型迷宮分辨學習后，康復組大鼠PS潛伏期較模型組縮短(P<0.05)。見表3。

表2 大鼠Y-型迷宮分辨學習后海馬CA3區(qū)PS增幅比較(%)

表3 大鼠Y-型迷宮分辨學習后海馬CA3區(qū)PS潛伏期比較(s)

3 討論

研究表明，海馬與近期記憶有關，損傷海馬可引起近期記憶的高度喪失，致使動物或患者喪失學習新事物和新技巧的能力；在大鼠實驗中還觀察到海馬參與近期記憶中的情節(jié)記憶過程，與空間位置的學習有關，海馬損傷或切除海馬，將造成順行性遺忘癥[3,6]。

在腦梗死等腦缺血性疾病時，由于谷氨酸興奮毒性作用，產(chǎn)生大量的自由基和興奮性氨基酸，導致細胞內(nèi)鈣離子超載，造成神經(jīng)細胞變性壞死，影響神經(jīng)元之間的信息傳遞，并最終導致腦功能障礙。海馬CA3區(qū)對缺氧缺血特別敏感。劉匯波等發(fā)現(xiàn)，大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后存活30 d時，動物的海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目顯著減少，大量神經(jīng)細胞的軸突缺失，海馬錐體細胞密度減低；模型大鼠還存在著與神經(jīng)元損傷呈正相關的學習記憶障礙[7-9]。

本實驗結(jié)果表明，雙側(cè)海馬梗死后，大鼠出現(xiàn)明顯的學習記憶能力下降，證實海馬對學習記憶功能的重要作用?？祻椭委熀骙-型迷宮分辨學習的能力明顯優(yōu)于模型組，說明康復訓練能促進海馬梗死大鼠的學習記憶功能的恢復?？祻陀柧毧赡芡ㄟ^改變梗死大鼠海馬的突觸結(jié)構(gòu)，活化突觸間傳遞通路，促進習得性LTP的產(chǎn)生[10-12]，進而增強海馬突觸效應的可塑性，改善大鼠認知功能，最終促進海馬梗死大鼠學習記憶功能的恢復。

人們發(fā)現(xiàn)在行為學習時，突觸傳遞有可塑性變化。行為訓練后，檢測到齒狀回出現(xiàn)突觸效應的增強，與行為條件反射的獲得是相互平行的。易立等觀察到大鼠條件飲水反應建立時，海馬CA3區(qū)突觸效應傳遞功能增強，并稱之為習得性LTP。這些結(jié)果表明，行為學習中突觸效應有LTP樣變化出現(xiàn)，提示它可能編碼學習和記憶。

實驗心理學研究表明[13]，學習的效率會受到學習任務安排形式的影響。緊跟在原學習之后的后來經(jīng)驗對先前學習的材料有干擾作用；同樣先前學習材料對同憶某些隨后學習的材料亦有干擾，這種現(xiàn)象稱為“倒攝干擾與前攝干擾”。有人對大鼠進行兩種學習任務訓練，發(fā)現(xiàn)在完成A訓練后緊接著進行B訓練，對海馬CA3區(qū)習得性LTP呈阻抑作用，而在完成A訓練后間隔4 h方進行B訓練，卻能加快習得性LTP的發(fā)展，PS峰值很快增至最高水平。

根據(jù)習得性LTP在4 h達到峰值的特點，本實驗中所有LTP測定值均為運動訓練或Y-型迷宮學習后4 h測定所得。結(jié)果發(fā)現(xiàn)康復組與模型組Y-型迷宮學習60次后PS峰值均增加，表明兩組大鼠均產(chǎn)生習得性LTP；康復組大鼠PS增幅較大，且PS潛伏期明顯縮短，與模型組相比差異有顯著性。但是當兩組Y-型迷宮正確分辨率達90%以上時，兩者PS增幅卻一樣多。分析其原因可能是平衡、抓握、旋轉(zhuǎn)等康復訓練實質(zhì)是偏癱鼠的運動再學習，這種訓練已使康復組大鼠產(chǎn)生一種習得性LTP，在此基礎上再經(jīng)Y-型迷宮學習則產(chǎn)生更大的LTP，即出現(xiàn)LTP的疊加效應；又由于PS增大有“飽和”現(xiàn)象[3,6]，即一旦達到最高水平就不再繼續(xù)增大，因此通過相互疊加，PS峰值很快發(fā)展到飽和水平。

行為訓練誘導的突觸效應增強可能存在一定的啟動機制，兩種行為間隔進行，都可正常地引起PS增大，而后一訓練引起的增大，卻是在前一訓練已使PS峰值增大的基礎上進行的，即兩種訓練作業(yè)所引起的PS峰值增大，不僅不互相干擾，而且還可以互為基礎，相互疊加，使PS峰值很快發(fā)展到飽和；同時行為學習改變樹突和突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)，增加運動皮層和海馬突觸數(shù)和密度，活化海馬和運動皮層的傳入通路；以及NMDA受體密度的增多，加強NMDA受體依賴LTP的產(chǎn)生，因而運動訓練改變突觸的傳遞效率。這也是運動訓練促使腦梗死大鼠學習記憶恢復的原因之一。

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