王瑩瑩王德培，2李可樂(lè)魏征劉鵬

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457)

納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)是發(fā)酵日本傳統(tǒng)食品納豆的益生菌，屬于枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種。納豆芽孢桿菌能分解大分子物質(zhì)，產(chǎn)生氨基酸、有機(jī)酸、寡聚糖等易于吸收的成分，這些成分具有多種保健功能，如抗菌、溶血栓、抗腫瘤、抗氧化、降血壓、預(yù)防骨質(zhì)疏松等；另外，納豆芽孢菌能分泌各種酶和維生素，促進(jìn)小腸黏膜細(xì)胞的增殖，保證腸道功能的正常[1]。因此，納豆芽孢桿菌廣泛用于各領(lǐng)域，對(duì)其微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。

本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的一株自日本市售納豆中分離的納豆芽孢桿菌為對(duì)象，優(yōu)化其液體發(fā)酵條件，為納豆芽孢桿菌的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種為納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)，由天津科技大學(xué)生化工程研究室保存。

種子培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/l、牛肉膏5.0 g/l、NaCl 5.0 g/l、pH值7.2～7.4，固體培養(yǎng)基需加20 g/l的瓊脂。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g/l、蛋白胨5.0 g/l、檸檬酸鈉1.0 g/l、MgSO4·7H2O 0.2 g/l、K2HPO44.0 g/l、KH2PO46.0 g/l，pH值7.0～7.2。

1.2 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：將納豆芽孢桿菌由肉湯斜面接種至種子培養(yǎng)基中（三角瓶，50 ml/250 ml），37℃、200 r/min培養(yǎng)11 h；

發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件根據(jù)試驗(yàn)進(jìn)程相應(yīng)改變。

1.3 測(cè)定方法[2]

1.3.1 測(cè)定吸光值

利用分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)為600 nm條件下測(cè)定菌液的吸光值(OD值)，測(cè)定時(shí)菌液用無(wú)菌生理鹽水稀釋10倍。

1.3.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

取培養(yǎng)好的納豆芽孢桿菌斜面，接種于含50 ml肉湯培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，振蕩培養(yǎng)11 h后，按接種量2%轉(zhuǎn)接25瓶50 ml/250 ml肉湯培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)，每1 h取樣一次，測(cè)定菌液的吸光值，以未接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.3.3 平板稀釋菌落計(jì)數(shù)

菌液采用10倍梯度稀釋,選取3個(gè)適當(dāng)稀釋度，用移液槍吸取100 μl菌液，把菌液分散地滴在肉湯平板上，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使菌液均勻分布。每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行。

1.4 培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

1.4.1 碳源優(yōu)化試驗(yàn)

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以蔗糖、葡萄糖、玉米粉、麩皮、可溶性淀粉作為碳源，添加量為5.0 g/l。在各組發(fā)酵培養(yǎng)基中接入納豆芽孢桿菌種子液，接種量2%，37℃、200 r/min培養(yǎng)11 h，各組分別活菌計(jì)數(shù)。

1.4.2 氮源優(yōu)化試驗(yàn)

分別以酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨、硝酸鈉作為氮源，添加量均為5.0 g/l。在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入納豆芽孢桿菌種子液，接種量2%，37℃、200 r/min培養(yǎng)11 h，測(cè)定各組吸光值并活菌計(jì)數(shù)。

1.4.3 初始pH值優(yōu)化試驗(yàn)

在上述培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上,分別調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,接種量2%,37℃、200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)11 h,測(cè)定各組吸光值并活菌計(jì)數(shù)。

1.4.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定Box-Behnken設(shè)計(jì)的自變量及其取值范圍，以10倍稀釋的發(fā)酵液的OD值為響應(yīng)值，運(yùn)用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析，對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)致優(yōu)化[3]。

1.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

采用最優(yōu)培養(yǎng)基配方,對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的接種量、裝液量和發(fā)酵溫度進(jìn)行優(yōu)化，測(cè)定各組吸光值。

1.5.1 接種量的優(yōu)化

分別選取0.5%、1%、2%、3%、4%和5%6個(gè)接種量水平，37℃、200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)11 h，測(cè)定各組吸光值并活菌計(jì)數(shù)。

1.5.2 裝液量的優(yōu)化

分別選取30、40、50、60、70 ml 5種裝液量（250 ml三角瓶）水平，37℃、200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)11 h，測(cè)定各組吸光值并活菌計(jì)數(shù)。

1.5.3 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)分別置于30、37、40、42、45℃搖床中，200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)11 h,測(cè)定各組吸光值并活菌計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線（見(jiàn)圖1）

圖1 納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

連續(xù)測(cè)定納豆芽孢桿菌發(fā)酵液的吸光值（5倍稀釋?zhuān)?，得到納豆芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線。由圖1可知，0～3 h為納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)延遲期，菌體數(shù)量極少；3～11 h為對(duì)數(shù)期,菌體數(shù)量急劇增多；在11 h時(shí)達(dá)到生長(zhǎng)的高峰期，在11～16 h時(shí),為納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，菌體生長(zhǎng)和死亡保持平衡狀態(tài)；自16 h后細(xì)菌數(shù)量開(kāi)始減少，進(jìn)入衰亡期。

2.2 碳源優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

圖2 不同碳源對(duì)納豆芽孢桿菌增殖的影響

將菌株置于不同碳源的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖2?？梢钥闯?，蔗糖對(duì)納豆芽孢桿菌增殖最有利，比最初選用的葡萄糖效果更好。以5.0 g/l的蔗糖做碳源，活菌數(shù)達(dá)到2.8×109cfu/ml，所以選擇蔗糖作為最佳碳源。

2.3 氮源優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

將菌株置于不同氮源的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),測(cè)定各組OD值,同時(shí)進(jìn)行活菌平板計(jì)數(shù),結(jié)果如圖3?？梢钥闯?酵母粉對(duì)納豆芽孢桿菌增殖最有利,比最初選用的蛋白胨效果更好。以5.0 g/l的酵母粉做氮源，活菌數(shù)達(dá)到5.6×109cfu/ml,所以選擇酵母粉作為最佳氮源。

2.4 培養(yǎng)基初始pH值優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

在不同初始pH值中的培養(yǎng)基中,納豆芽孢桿菌增殖情況如圖4,發(fā)現(xiàn)活菌數(shù)隨著初始pH值的升高先增加后降低，在初始pH值為7.0～7.5時(shí)，生長(zhǎng)得較好。其中在初始pH值為7.0時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到6.3×109cfu/ml。

2.5 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

以碳源（X1）、氮源（X2）和初始pH值（X3）為自變量，以10倍稀釋的發(fā)酵液OD值為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行響應(yīng)面分析（因素水平見(jiàn)表1，每組2個(gè)重復(fù)）并建立納豆芽孢桿菌增殖培養(yǎng)的回歸模型[4]，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值見(jiàn)表2。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值表

運(yùn)用Design Expert 7.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，回歸方程如下：

式中：Y——10倍稀釋后發(fā)酵培養(yǎng)基OD值的預(yù)測(cè)值；

x1、x2、x3——分別代表碳源、氮源、初始pH值的編碼值。

回歸方程的方差分析和可信度分析結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)回歸分析結(jié)果

表4 模型可信度分析

由表3可知，回歸模型顯著可靠（P＜0.000 1）；因子X(jué)1、X3、、為顯著模型項(xiàng)；而失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），提示本模型能充分反映實(shí)際情況[5]。

由表4可知,模型的決定系數(shù)(R-Squared)為0.980 0,說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性；校正決定系數(shù)（Adj R-Squared）為0.954 4，說(shuō)明該模型能解釋95.44%響應(yīng)值的變化，僅有總變異的4.56%不能用此模型來(lái)解釋。因此，回歸方程的擬合程度很好,預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性[6]。模型的信噪比(Adeq Precision)為16.724 0，一般來(lái)說(shuō)，模型的信噪比大于4就是較好的模型，進(jìn)一步說(shuō)明本模型設(shè)計(jì)非常成功，即回歸方程給納豆芽孢桿菌的增殖提供了一個(gè)較合適的模型。CV(Y的變異系數(shù))表示試驗(yàn)的精確度，CV值越高，試驗(yàn)的可靠性越低，本設(shè)計(jì)試驗(yàn)中CV值為1.470 0%，數(shù)值較小，說(shuō)明試驗(yàn)操作可信。

響應(yīng)面中各因素交互作用的立體圖及等高線圖見(jiàn)圖5，由圖5可知，模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)是極大值點(diǎn)，通過(guò)嶺脊分析[7]，得到極大值所對(duì)應(yīng)的各主要因素的編碼值(x1、x2、x3)(-0.116、0.065、0.15)。由公式x1=(X1-30)/5，x2=(X2-8)/2，x3=(X3-7.2)/0.2，得到各主要因素(X1、X2、X3)的實(shí)際值為（29.42、8.13、7.23），即碳源添加量29.42 g/l、氮源添加量8.13 g/l、培養(yǎng)基初始pH值7.23。該模型預(yù)測(cè)的OD值為0.651。

2.6 Box-Behnken回歸模型驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由于得到的最佳條件未包括在響應(yīng)面優(yōu)化的15個(gè)試驗(yàn)中，需進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方下，即碳源添加量29.42 g/l，氮源添加量8.13 g/l，初始pH值為7.23，在37℃、200 r/min條件下發(fā)酵11 h，然后測(cè)定發(fā)酵液OD值和活菌計(jì)數(shù)。共重復(fù)了3次試驗(yàn)，每次試驗(yàn)都設(shè)有2組平行，測(cè)得發(fā)酵液10倍稀釋后OD值為0.655（此值為平均值）（相應(yīng)的活菌數(shù)為6.7×109cfu/ml），與試驗(yàn)預(yù)測(cè)值0.651非常接近，這表明試驗(yàn)值和實(shí)際值之間具有良好的擬合性，優(yōu)化模型可靠。

2.7 接種量?jī)?yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

圖6 接種量對(duì)納豆芽孢桿菌增殖的影響

在不同接種量的培養(yǎng)基中，納豆芽孢桿菌增殖情況如圖6，發(fā)現(xiàn)活菌數(shù)隨著接種量的升高先增加后降低，在接種量為3%時(shí)，納豆芽孢桿菌數(shù)達(dá)到7.0×109cfu/ml。

2.8 裝液量?jī)?yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

在不同裝液量的培養(yǎng)基中，納豆芽孢桿菌增殖情況如圖7，發(fā)現(xiàn)活菌數(shù)隨著裝液量的增加先升高后降低，在裝液量為50 ml時(shí)，達(dá)到7.0×109cfu/ml。

2.9 培養(yǎng)溫度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖8）

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，納豆芽孢桿菌在30～45℃均可生長(zhǎng)，但40℃時(shí)生長(zhǎng)狀況最好。選擇40℃為最佳發(fā)酵溫度，在此條件下，納豆芽孢桿菌活菌數(shù)達(dá)到7.5×109cfu/ml。

3 結(jié)論

采用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)法，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液吸光值和平皿活菌落計(jì)數(shù)，對(duì)納豆芽孢桿菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,最終確定納豆芽孢桿菌最佳增殖培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基為蔗糖29.42 g/l、酵母粉8.13 g/l、檸檬酸鈉1.0 g/l、MgSO4·7H2O 0.2 g/l、K2HPO44.0 g/l、KH2PO46.0 g/l、初始pH值7.23、裝液量50 ml/250 ml、接種量3%、發(fā)酵溫度為40℃、發(fā)酵時(shí)間11 h。經(jīng)過(guò)一系列優(yōu)化，納豆芽孢桿菌的單位活菌數(shù)可達(dá)到7.5×109cfu/ml，為其在各方面的廣泛應(yīng)用打下良好基礎(chǔ)。

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