彭 潔，張 虹

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院眼科，四川 成都 610072;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院眼科，湖北 武漢 430030)

細(xì)胞外基質(zhì)是房水流出小梁網(wǎng)排出系統(tǒng)時(shí)的主要阻力。房水流出通道組織中細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積，將導(dǎo)致細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間連接緊密，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、僵硬，同時(shí)沉積的細(xì)胞外基質(zhì)堵塞小梁網(wǎng)，尤其阻塞Schlemm管的鄰管小梁網(wǎng)組織，使房水流出阻力增加，出現(xiàn)病理性眼內(nèi)壓升高［1～3］。我們前期實(shí)驗(yàn)中地塞米松(dexamethasone，DEX)能誘導(dǎo)小梁細(xì)胞水通道蛋白1(aquaporin-1，AQP1)表達(dá)改變［4］。DEX能使小梁網(wǎng)系統(tǒng)的細(xì)胞外基質(zhì)分泌變化也已被多項(xiàng)研究證實(shí)［2，5］，那么該過(guò)程中，是否同時(shí)有AQP1參與，2010年6月至2011年12月本實(shí)驗(yàn)就此作了初步探討，以揭示AQP1在小梁細(xì)胞上生理功能的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 人眼小梁組織 人眼小梁組織來(lái)源于意外死亡且無(wú)眼部疾患者，均于身故24小時(shí)內(nèi)取材。該研究項(xiàng)目經(jīng)四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者家屬詳知實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮脱芯糠桨福炇鹆擞稍撛簜惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)的患者知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)，胎牛血清(美國(guó)HYCLONE公司)，兔抗人AQP1多克隆抗體(美國(guó)CHEMICON公司)，兔抗人神經(jīng)原特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)多克隆抗體，兔抗人纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)多克隆抗體，鼠抗人層粘連蛋白(laminin，LN)單克隆抗體，鼠抗人膠原蛋白 I(collagen I，CAI)單克隆抗體、鼠抗人膠原蛋白IV(collagen IV，CAIV)單克隆抗體、FITC熒光羊抗兔二抗，免疫組化試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)，AQP1反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，AS-ODN)(北京賽百盛公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人眼小梁細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 于無(wú)菌條件下，在角膜緣后5 mm處環(huán)形剪開(kāi)眼球，去除玻璃體、晶狀體及葡萄膜，手術(shù)顯微鏡下找到小梁網(wǎng)，用眼科鑷順其方向撕下海綿狀小梁網(wǎng)，角鞏膜交界處可見(jiàn)位置很淺的鞏膜內(nèi)溝。將小梁網(wǎng)剪成細(xì)小碎塊，接種于培養(yǎng)瓶或6孔培養(yǎng)板，置于含20%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。原代培養(yǎng)采用3或4只眼的小梁組織。待融合后以胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)，取傳3代細(xì)胞，于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NSE、FN、LN、CAI、CAIV等人眼小梁細(xì)胞特異性標(biāo)記，鑒定人眼小梁細(xì)胞。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 DEX(美國(guó)SIGMA公司)用50%乙醇溶解，繼以DMEM/F12稀釋?zhuān)^(guò)濾后存于4℃冰箱備用，所含乙醇的最終濃度不超過(guò)0.05%，不影響細(xì)胞的分裂增殖。AQP1AS-ODN，5'-CAGCCCTCCAGAAGAGCTTCTTCTT-3'，用來(lái)減少培養(yǎng)小梁細(xì)胞AQP1的表達(dá)，5'端頭9個(gè)堿基和3'端尾7個(gè)堿基被硫化修飾。傳三代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，傳于放有載玻片的培養(yǎng)板中，待細(xì)胞接近融合，將培養(yǎng)孔隨機(jī)分成6組，每組32孔。對(duì)照組(A組)不加藥，其余每 組分別給 予 DEX(SIGMA，美國(guó))0.4 μg/ml(B組)、DEX 0.4 μg/ml+AQP1ASODN 0.625 μg/ml(C組)、DEX 0.4 μg/ml+ AQP1AS-ODN 1.25 μg/ml(D組)、DEX 0.4 μg/ml+ AQP1AS-ODN 2.5 μg/ml(E組)、DEX 0.4 μg/ml+ AQP1AS-ODN 5 μg/ml(F組)。第3天換培養(yǎng)基和重新給予同樣藥物。

1.3.3 免疫組化檢測(cè)FN、LN、CAI及CAIV 5天后，載玻片取出，1∶1丙酮和酒精固定，PBS漂洗。正常山羊血清封閉非特異背景孵育30 min，傾去血清。分別依次滴加PBS稀釋的一抗即抗FN、LN、CAI及CAIV抗體，4℃冰箱過(guò)夜，與一抗相對(duì)應(yīng)的生物素標(biāo)記的二抗IgG，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，過(guò)鹽酸酒精，1‰氨水，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片?？瞻讓?duì)照組則加入PBS代替一抗，余操作步驟同。封片后每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野輸入計(jì)算機(jī)，經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像分析處理系統(tǒng)在同一光強(qiáng)、同一放大倍數(shù)下，檢測(cè)每個(gè)視野中邊界清晰、胞漿互不重疊的人眼小梁細(xì)胞核周棕黃色區(qū)域的吸光度(A值)，每種濃度重復(fù)檢測(cè)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析和q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人小梁細(xì)胞培養(yǎng)及特征 原代接種培養(yǎng)經(jīng)過(guò)2周左右的潛伏期，細(xì)胞由組織塊長(zhǎng)出，形態(tài)不規(guī)則，呈內(nèi)密外疏的單層生長(zhǎng)，經(jīng)8～12天細(xì)胞融合，融合時(shí)呈放射狀、旋渦狀，細(xì)胞體緊密連接，無(wú)重疊生長(zhǎng)。傳代。FN、LN、CAI、CAIV及NSE免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性，結(jié)合細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程、形態(tài)學(xué)觀察及免疫組織化學(xué)特性，所培養(yǎng)的細(xì)胞符合人眼小梁細(xì)胞特征。

2.2 DEX、AS-ODN對(duì)小梁細(xì)胞FN、LN、CAI及CAIV表達(dá)的影響 結(jié)果顯示培養(yǎng)的人眼小梁細(xì)胞可以合成、分泌FN、LN、CAI及CAIV。0.4 μg/ml地塞米松能刺激培養(yǎng)小梁細(xì)胞FN、LN及CAIV表達(dá)明顯增強(qiáng)，使CAI表達(dá)減少，均與對(duì)照組相比差異有顯著性意義。在C、D、E、F各組，AQP1AS-ODN可以降低由0.4 μg/ml地塞米松引起的FN、LN、CAIV表達(dá)增強(qiáng)，隨著AQP1AS-ODN濃度的逐步加大，可將FN、LN、CAIV表達(dá)量降至接近正常對(duì)照組，在 LN類(lèi)，甚至低于正常對(duì)照組。同時(shí)，AQP1AS-ODN可以增加由0.4 μg/ml地塞米松引起的CAI表達(dá)減少，隨著AS-ODN濃度的逐步加大，可將CAI表達(dá)量增至接近正常對(duì)照組。FN類(lèi)，B組與A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，C、D、E、F組與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LN類(lèi)，A、D組與B、C組與E、F組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。CAI類(lèi)，B組與A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，C、D、E、F組與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CAIV類(lèi)，B、C、D組與A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，E、F組與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。各組平均吸光度A值見(jiàn)表1，圖1～圖4。

表1 5天后，各組小梁細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)平均吸光度A值

圖1 FN在人眼小梁細(xì)胞的表達(dá)(×200)a:對(duì)照組，b:DEX 0.4 μg/ml組，c:DEX 0.4 μg/ml+AQP1AS-ODN 5 μg/ml組;圖2 LN在人眼小梁細(xì)胞的表達(dá)(×200)a:對(duì)照組，b:DEX 0.4 μg/ml組，c:DEX 0.4 μg/ml+AQP1AS-ODN 5 μg/ml組;圖3 CAI在人眼小梁細(xì)胞的表達(dá)(× 200)a:對(duì)照組，b:DEX 0.4 μg/ml組，c:DEX 0.4 μg/ml+AQP1AS-ODN 5 μg/ml組;圖4 CAIV在人眼小梁細(xì)胞的表達(dá)(×200)a:對(duì)照組，b:DEX 0.4 μg/ml組，c:DEX 0.4 μg/ml+AQP1AS-ODN 5 μg/ml組

3 討論

3.1 小梁細(xì)胞外基質(zhì)中FN、LN、CAI及CAIV參與激素性青光眼的發(fā)病 小梁網(wǎng)由若干小梁帶組成。小梁帶是有很強(qiáng)變應(yīng)性和彈性的組織，其軸心是由CAI和CAIII及彈力硬蛋白組成的膠原軸，膠原軸外環(huán)繞由CAIII、CAIV、CAV、FN和肝素硫酸鹽糖蛋白構(gòu)成的基質(zhì)層，呈低電子密度的均質(zhì)狀，其最外層由小梁網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞包繞［6］。對(duì)正常眼和原發(fā)性開(kāi)角型青光眼小梁網(wǎng)和Schlemm管基底膜中CAIV、FN及LN超微結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)、成分及定位的研究表明，二者是類(lèi)似的［7］。

CA是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白質(zhì)。CAI為條紋膠原，存在于小梁核心、小梁柱和近小管的組織。CAIV分布于基底膜。CA的特征是形成不溶性纖維而具有高度的抗張性。如果CA的功能或數(shù)量發(fā)生異常，必將影響到細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和小梁網(wǎng)的篩狀結(jié)構(gòu)，從而影響到房水的排出。非膠原糖蛋白主要有 FN和 LN，兩者對(duì)細(xì)胞粘著起重要作用［8，9］。二者是基膜的主要結(jié)構(gòu)成分，在生物過(guò)程中扮演著重要的角色，包括細(xì)胞附著和傳遞、分化、遷徒和傷口治愈。FN通過(guò)細(xì)胞膜與微絲束聯(lián)系。細(xì)胞一般不直接與CAIV或蛋白聚糖結(jié)合，而是通過(guò)LN將細(xì)胞固定于基膜上。FN是細(xì)胞外基質(zhì)中的重要成分，主要起黏附作用，可分別與不同的大分子或細(xì)胞結(jié)合，包括膠原、肝素、纖維蛋白、肌動(dòng)蛋白、轉(zhuǎn)化增強(qiáng)因子、DNA等，同時(shí)FN與膜下微絲在細(xì)胞與底層接觸區(qū)形成跨膜聯(lián)系，從而影響細(xì)胞骨架排列，且對(duì)細(xì)胞有趨化和調(diào)理并加促增殖等作用［10］。有人測(cè)得牛眼房水流出道中FN濃度比血漿中低100倍，而在原發(fā)性開(kāi)角型青光眼的患者眼前房流出道中濃度明顯增加，尤其是在Schemm管內(nèi)壁和近管組織。如果小梁細(xì)胞合成和分泌這兩種蛋白濃度增加而降解酶即纖維蛋白溶酶原不增加，必將引起這兩種蛋白在小梁網(wǎng)房水流出道中堆積，阻塞小梁網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)，使房水排出受阻。其中FN的增加是進(jìn)行性的，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，同樣情況下，人眼小梁細(xì)胞對(duì)FN的表達(dá)存在個(gè)體差異。DEX誘導(dǎo)下，激素敏感者表達(dá)增加，除去誘導(dǎo)后不可逆，但可被糖皮質(zhì)激素拮抗劑部分拮抗。DEX引起細(xì)胞外基質(zhì)中FN、LN的表達(dá)增加，提示二者堆積參與了激素性青光眼的發(fā)病。

3.2 AQP1參與DEX誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)變化 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，DEX誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)中FN，LN、CAIV的表達(dá)增加，CAI表達(dá)減少。我們前期研究提示，0.4 μg/ml可以使AQP1表達(dá)較大限度的增多［4］，這與卓業(yè)鴻等［11］的研究結(jié)果是相似的，故選擇用0.4 μg/ml的DEX作為AQP1表達(dá)增多的誘導(dǎo)劑來(lái)處理培養(yǎng)的人眼小梁細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)在0.4 μg/ ml DEX誘導(dǎo)的同時(shí)，給予AQP1AS-ODN作用，旨在消除DEX所導(dǎo)致的AQP1表達(dá)增多帶來(lái)的影響，檢測(cè)AQP1AS-ODN施予前后的細(xì)胞外基質(zhì)變化，探討排除AQP1影響后的細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，研究AQP1是否參與 DEX增加細(xì)胞外基質(zhì)分泌的過(guò)程。AQP1AS-ODN是基因水平上AQP1的抑制劑，它特異阻斷細(xì)胞內(nèi)AQP1的轉(zhuǎn)錄與翻譯。結(jié)果表明，AQP1AS-ODN在濃度用到合適的劑量時(shí)，均能逆轉(zhuǎn)0.4μg/ml DEX所誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)變化的現(xiàn)象。AQP1AS-ODN可以降低由0.4 μg/ml DEX引起的FN、LN、CAIV表達(dá)增加，隨著其濃度的逐步加大，可將FN、LN、CAIV表達(dá)量降至接近正常對(duì)照組。在LN類(lèi)，甚至低于正常對(duì)照組，這可能是影響了其它復(fù)雜機(jī)制。同時(shí)，AS-ODN可以增加由0.4 μg/ml DEX引起的CAI表達(dá)減少，隨著AS-ODN濃度的逐步加大，可將CAI表達(dá)量增至接近正常對(duì)照組。這些都提示AQP1或以細(xì)胞膜水轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，維持細(xì)胞正常生理功能的角色，或以作用于AQP1啟動(dòng)子中糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件等角色參與了DEX增加細(xì)胞外基質(zhì)分泌的過(guò)程。

如果我們?cè)诩に匦郧喙庋鄣闹委熤锌紤]到這一點(diǎn)，結(jié)合我們其它對(duì)AQP1的生理功能研究，深入AQP1在人眼小梁細(xì)胞的其它離體或在體研究，在以后科研及臨床中加以明確其意義，我們將會(huì)為青光眼的防治帶來(lái)新局面。

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