王勇，王春霞，姚長義，王運(yùn)杰

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110001；2.附屬第四醫(yī)院眼科，沈陽 110005）

缺血再灌注大鼠腦表超氧陰離子產(chǎn)生的可視化檢測

王勇1，王春霞2，姚長義1，王運(yùn)杰1

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110001；2.附屬第四醫(yī)院眼科，沈陽 110005）

目的對缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)區(qū)域超氧陰離子的產(chǎn)生進(jìn)行可視化檢測。方法 用MitoSOXTM（超氧陰離子熒光標(biāo)記探針）標(biāo)記大鼠腦表區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞，共焦點(diǎn)激光顯微鏡活體觀察在缺血（10min）再灌注（30min）過程中，腦表區(qū)域O2-產(chǎn)生的情況。結(jié)果 缺血開始3min后，O2-產(chǎn)生開始增加，并一直持續(xù)到再灌注后10min停止增長。結(jié)論在缺血期及再灌注早期O2-生成增加，且動(dòng)脈附近區(qū)域O2-產(chǎn)生量要多于其他區(qū)域。

缺血再灌注；前腦缺血；氧自由基；活體成像

腦缺血再灌注損傷在臨床上非常多見。大量研究揭示自由基在缺血再灌注損傷機(jī)制中扮演著重要角色［1，2］，但此結(jié)論多建立在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及免疫組化研究等離體實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，關(guān)于自由基活體檢測的報(bào)道則甚少［3，4］。本研究以SD大鼠為對象，通過4血管阻斷法建立前腦缺血再灌注損傷模型，利用共焦點(diǎn)激光熒光顯微鏡活體觀察自由基產(chǎn)生情況，以期建立一個(gè)自由基可視化檢測平臺。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性Sprague-Dawley大鼠13只，9周齡，體質(zhì)量250～300g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。將大鼠隨機(jī)分為血流測定組（腦組織不染色，只對缺血再灌注腦表腦血流進(jìn)行測定，n=5），缺血組（腦表腦組織熒光染色后，接受缺血再灌注，n=5）和對照組（腦表腦組織熒光染色后不接受缺血再灌注，n=3）。

1.2 方法

1.2.1 缺血模型制作：采用改良4血管阻斷法（4-vessel occlusion，4-VO）制作大鼠全腦缺血再灌注損傷模型：閉塞兩側(cè)椎動(dòng)脈，雙側(cè)頸總動(dòng)脈安置血管阻斷氣囊，缺血時(shí)間10min，再灌注30min，缺血過程中進(jìn)行體溫、血壓、心率等生命指標(biāo)監(jiān)測；缺血前行靜脈血?dú)夥治觥?/p>

1.2.2 腦血流測定：水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉后，頭架固定大鼠，暴露右側(cè)顱骨，于Bregma點(diǎn)后3.6mm、中線旁開2mm處，開1個(gè)3mm直徑骨窗，硬膜保持完整。應(yīng)用激光多普勒血流測定儀（Advance Co Ltd，Tokyo，Japan） 監(jiān)測腦血流變化情況。

1.2.3 MitoSOXTM腦表活體染色：開顱過程同上，小心剪開硬膜，將MitoSOX（5μmol/L；Invitrogen；Ex/Em=510/580nm）通過顯微注射泵注射至皮層下3mm，注射泵氣壓 0.1bar，推注時(shí)間 0.1s［5］，在熒光染劑孵育30min后，用生物膠結(jié)合載玻片封閉骨窗，骨窗下用人工腦脊液填充。

1.2.4 O2-分子活體成像：使用的正立顯微鏡（B X50WI，Olympus，Japan）裝配有共焦點(diǎn)掃描系統(tǒng)（CSU-21，Yokogawa，Japan），相機(jī)（C2400，Hamamatsu Photonics，Japan）， 信 號 放 大 器（C2400-21SV，Hamamatsu Photonics，Japan），10倍水鏡觀察。缺血前5min開始基線采集，缺血10min，再灌注30min，觀察時(shí)間共45min。每30s采集圖像1次，共計(jì) 90張。采用 A quaCosmos software（Hamamatsu Photonics，Japan）軟件分析圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件為SPSS 10.0，組間比較方法為t檢驗(yàn)或單因素方差分析，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦血流測定

缺血組與對照組之間，缺血前血?dú)饨Y(jié)果無差異。4血管被阻斷后，腦表血流量能下降至正?；€的（20±10）%；撤銷阻斷后，腦血流迅速恢復(fù)并產(chǎn)生1個(gè)一過性過灌注峰［（110±10）%］，過灌注維持 2～3min后，血流再次回復(fù)到基線水平（圖1）。

2.2 腦表MitoSOXTM的熒光變化

缺血時(shí)，觀測到觀察窗內(nèi)MitoSOXTM的熒光強(qiáng)度上升到（160±10）%，再灌注時(shí)繼續(xù)上升至（182±11）%（圖2）。進(jìn)一步對腦表各個(gè)部位進(jìn)行圖像分析，發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈附近區(qū)域熒光上升最高為（222±13）%，富含毛細(xì)血管床區(qū)域?yàn)椋?62±7）%。提示O2-的產(chǎn)生具有部位特異性（圖3）。

3 討論

在缺血再灌注過程中會(huì)有大量的自由基產(chǎn)生，進(jìn)而引發(fā)一系列病理變化，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能障礙乃至死亡。但對自由基的檢測一直限于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、免疫組化研究等離體實(shí)驗(yàn)水平，活體水平檢測報(bào)道甚少。電子自旋共振譜 （electron spin-resonance spectroscopy，ESR）、自旋捕集和微量滲析等技術(shù)因操作復(fù)雜、費(fèi)用高昂，普及受限。上述方法均非即時(shí)檢測，無法把握穩(wěn)定性極差的自由基的實(shí)際產(chǎn)生［6～8］。鑒于此，本研究擬采用活體成像技術(shù)，建立一個(gè)自由基可視化檢測平臺。

MitoSOXTM是一種新型的自由基熒光探針，能高效率的滲透過細(xì)胞膜，進(jìn)入線粒體內(nèi)，高選擇的與O2-超氧陰離子結(jié)合，發(fā)出紅色熒光。但是與Fluo-2，F(xiàn)luo-3等鈣離子螯合劑不同，MitoSOXTM被氧化后無法再解離，所以MitoSOXTM熒光增強(qiáng)說明O2-生成增加；MitoSOXTM熒光無變化說明O2-生成無增加。另外，我們采用的是氣動(dòng)顯微注射染色法，可以使熒光染劑在最短的時(shí)間內(nèi)擴(kuò)散到皮層腦組織內(nèi)，減少了孵育時(shí)間及熒光褪色。

在活體成像研究中，腦搏動(dòng)（隨著呼吸、心跳）對圖像采集影響非常大。我們采用了透明閉合骨窗及骨窗下人工腦脊液填充的方法，最大程度地減少了腦搏動(dòng)，保持觀察范圍內(nèi)焦點(diǎn)及景深的穩(wěn)定。通過閉合骨窗的載玻片，光鏡下可以在解剖學(xué)上區(qū)分動(dòng)靜脈及毛細(xì)血管區(qū)，對比熒光像可以對比不同區(qū)域的熒光變化。

本研究結(jié)果提示，在缺血期及再灌注早期O2-大量產(chǎn)生，這與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果一致［4，8］。我們利用活體成像技術(shù)對腦表不同區(qū)域的自由基產(chǎn)生進(jìn)行了可視化分析，結(jié)果提示在動(dòng)脈周圍區(qū)域O2-產(chǎn)生要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其他區(qū)域。其原因可能是：（1）動(dòng)脈附近氧濃度高，O2-產(chǎn)生所必需的原料充足；（2）黃嘌呤氧化酶在內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達(dá)，該酶能促進(jìn)O2-的形成［9］。

本研究中我們對經(jīng)典的4-VO法做了部分改良，采用可充氣球囊壓迫頸總動(dòng)脈代替了以往的尼龍繩牽拉法。有效降低了因術(shù)者牽拉尼龍線力度過大而導(dǎo)致血管壁損傷斷裂出血或因牽拉力量不足導(dǎo)致缺血效果不確實(shí)等情況的發(fā)生。腦血流測定結(jié)果也提示改進(jìn)后的缺血模型在缺血強(qiáng)度上與經(jīng)典方法接近。

本研究初步確立了一種活體成像自由基檢測新方法，確立了小動(dòng)物腦組織活體自由基檢測平臺。通過更換熒光探針，對腦表其他信號傳導(dǎo)，如其他自由基、鈣離子變化及膜電位變化等進(jìn)行可視化檢測，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

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（編輯王又冬，英文編輯劉寶林）

Superoxide Radical Production in Rat Ischemic Brain Measured by Intravital Fluorescence Imaging

WANG Yong1，WANG Chun-xia2，YAO Chang-yi1，WANG Yun-jie1
（1.Department of Neurosurgery，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Ophthalmology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110005，China）

ObjectiveWe examined reactive oxygen species （ROS）generation on cerebral ischemia/reperfusion rats by intravital fluorescence imaging.MethodsIn anesthetized adult rats，MitoSOX （a fluorescent dye for superoxide radical） was injected into cortices by a pressurized bolus.Through a closed cranial window，fluorescent images were taken with a confocal microscope on 10-minute forebrain ischemia and 30-min reperfusion.ResultsIn ischemia and the early period of reperfusion，the MitoSOX fluorescence intensity significantly increased to 183%，and these increases were significant in the areas adjacent to the arteries.ConclusionO2-production increased in ischemia and the early period of reperfusion period.The O2-production was location-selective，being significant in the areas adjacent to the arteries.This method was useful for investigating intracellular in situ ROS production.

cerebral ischemia and/or reperfusion；in vivo imaging；oxidative stress

R743.3

A

0258-4646（2012）01-0018-03

doiCNKI：21-1227/R.20120113.1028.026

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20120113.1028.026.html

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81000565/H0914）

王勇（1975-），男，主治醫(yī)師，博士.E-mail：wangyong@mail.cmu.edu

2011-07-04

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2012-01-1310：28