范西惠，韓佳利，閻艾慧，李明彥，趙明俊

（1.揚州第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，江蘇 揚州 225001；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，沈陽 110001）

鼻腔鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤（nasal inverted papilloma，NIP）是一種鼻部常見的良性腫瘤，臨床上有侵襲性生長、易復(fù)發(fā)、易惡變的特點，目前研究認(rèn)為NIP的發(fā)生發(fā)展過程是多種基因蛋白相互作用的結(jié)果，了解這些基因的表達變化及相關(guān)調(diào)控機制不僅有助于明確NIP的發(fā)病機制，而且為NIP的早期診斷、預(yù)防、治療提供了可靠的理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧化酶 2（cycloxygenase-2，COX-2）在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中扮演了極其重要的角色。COX-2過度表達可導(dǎo)致前列腺素產(chǎn)物增加，而前列腺素產(chǎn)物可通過抑制細胞凋亡及分化、促進血管生成等多種途徑，促進腫瘤的形成［1］。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測NIP及其惡變組織中COX-2蛋白的表達，探討COX-2與NIP發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2006年1月至2008年12月期間中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科72例NIP患者手術(shù)切除的瘤體組織。所有患者隨訪18個月，診斷均經(jīng)病理證實，且術(shù)前未接受放化療及長期服用COX-2抑制劑。其中男性42例，女性30例，年齡21～80歲，平均年齡為51.53歲。按Krouse分期［2］：T1期 11例、T2期 19例、T3期 30例、T4期12例。72例根據(jù)病理結(jié)果是否癌變分為2組：NIP組（60例）和NIP惡變組（12例）。另選擇10例因結(jié)構(gòu)性鼻炎同期住院行鼻中隔矯正、下鼻甲部分切除或泡狀中鼻甲手術(shù)患者的鼻甲黏膜標(biāo)本作為正常對照，其中男性6例，女性4例，平均年齡49歲。以上標(biāo)本4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片置于經(jīng)多聚賴氨酸防脫玻片上備用。

1.2 主要試劑與方法

兔抗人COX-2多克隆抗體、SABC組化試劑盒、DAB顯色劑購自武漢博士德生物科技公司。采用免疫組化SABC法檢測COX-2蛋白的表達，染色步驟按說明書進行，用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知胃癌的陽性切片作為陽性對照。

COX-2免疫組化染色以細胞質(zhì)出現(xiàn)特異性棕黃顆粒狀為陽性染色細胞。采用高清晰度彩色病理圖文分析圖像軟件，在顯微鏡物鏡（×40）及同一外部條件下采集圖像，測定陽性染色細胞的平均光密度值（average optical density，AOD）用以表示各組織中COX-2表達的相對量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用±s表示，行方差分析和t檢驗，檢驗水準(zhǔn)：α=0.05（雙側(cè)）。

2 結(jié)果

2.1 COX-2蛋白的表達比較

COX-2蛋白在正常鼻黏膜組織中不表達，在NIP及其癌變組織的上皮細胞胞質(zhì)中陽性表達，表現(xiàn)為淺黃或深棕色顆粒（圖1）；PBS緩沖液代替一抗的陰性對照和陰性片不著色。正常鼻黏膜組、NIP組和NIP惡變組比較，COX-2蛋白的AOD值逐漸增高，分別為（0.14552±0.07937）、（0.18552±0.02201）、（0.228 58±0.027 82）。3組經(jīng)單因素方差分析后兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 COX-2表達與NIP復(fù)發(fā)的關(guān)系

60例未惡變NIP患者，分為復(fù)發(fā)組和初發(fā)組。復(fù)發(fā)組16例患者，曾有1～3次的手術(shù)史。復(fù)發(fā)組和初發(fā)組COX-2的表達分別為（0.183 52±0.019 9）和（0.228 58±0.022 6），2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 NIP組織中COX-2表達與臨床參數(shù)的關(guān)系

NIP組中COX-2的表達在不同的發(fā)病年齡、性別間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而吸煙者COX-2的表達高于不吸煙者（P<0.05）。T3+T4期NIP組織中COX-2表達高于T1+T2期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表 2。

3 討論

NIP是常見的鼻腔鼻竇良性腫瘤，發(fā)病率約占鼻腔鼻竇腫瘤的0.5%～7%。NIP的重要生物學(xué)特征是術(shù)后易復(fù)發(fā)和癌變，惡變率為5%～32%，且多惡變?yōu)轺[狀細胞癌，極少數(shù)惡變?yōu)橄侔?］。Roh 等［4］發(fā)現(xiàn)炎性細胞很少出現(xiàn)在其他類型的鼻乳頭狀瘤中，卻在NIP中多見，我們在NIP的組織切片中也看到了大量淋巴細胞的浸潤現(xiàn)象，因而推測NIP的發(fā)生與最初炎性反應(yīng)有關(guān)。前列腺素（prostaglandin，PG）是一類重要的炎性介質(zhì)，在各種急慢性炎癥中發(fā)揮著重要作用。COX是一種膜結(jié)合蛋白，為PG合成過程中的一個重要限速酶，COX有COX-1、COX-2、COX-3亞型。其中COX-2是一種“早期即刻反應(yīng)”基因，其在靜息狀態(tài)下不表達，當(dāng)細胞受到如內(nèi)毒素、感染因子、生長因子、致癌物等因素刺激后便從頭合成，COX-2mRNA量迅速增加，其升高可達20～40倍［5］。本研究顯示COX-2蛋白在正常鼻黏膜中不表達，當(dāng)鼻黏膜伴隨炎癥時可有少量表達，說明NIP的形成可能與慢性炎癥刺激有關(guān)。

本研究中復(fù)發(fā)組COX-2的表達和初發(fā)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明術(shù)后復(fù)發(fā)與組織中COX-2的表達可能無明顯關(guān)系。導(dǎo)致NIP術(shù)后復(fù)發(fā)的主要因素是手術(shù)切除不徹底，特別是額竇和篩板受浸時，手術(shù)難度增加，瘤體殘留機會增多；其次，手術(shù)造成的腫瘤種植也不可忽略。

表2 N I P組織中C O X-2表達在不同臨床指標(biāo)中的比較Tab.2 The corre lation between C ox-2 expression and clinicopa thological features of NIP

近年研究表明COX-2在鼻咽癌、喉癌、下咽癌、口腔癌等頭頸部腫瘤的原發(fā)灶中表達明顯增加［6］。COX-2促進腫瘤惡變可能的機制為：（1）促進腫瘤血管的形成，為腫瘤的生長和浸潤提供必需的營養(yǎng)；（2）刺激bcl-2蛋白表達，促進細胞增殖和抑制細胞凋亡，使細胞增殖和凋亡失衡；（3）誘導(dǎo)前致癌物的活化［7］。本研究中發(fā)現(xiàn)，從NIP形成至NIP惡變的過程中COX-2的表達量進一步升高，這表明在NIP形成后，炎性刺激因素非但未去除，反而蓄積并慢性累加，致COX-2蛋白的再激活，誘發(fā)腫瘤組織惡變。

COX-2蛋白表達與多項NIP相關(guān)臨床參數(shù)進行比較，結(jié)果顯示NIP組織中COX-2的表達與患者的年齡、性別無明顯相關(guān)，與吸煙、Krouse分期相關(guān)。結(jié)果顯示，從T1+T2期到T3+T4期，隨著NIP病變累及范圍的加重，COX-2蛋白表達水平逐漸升高，這說明COX-2蛋白表達與NIP病變侵襲范圍相關(guān)。另外，NIP吸煙者COX-2表達同不吸煙者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。吸煙能誘導(dǎo)COX-2的過度表達和活性增強，促使前列素 E2（prostaglandin E2，PGE2）的釋放，而PGE2有助于腫瘤的癌變和生長［8］；提示吸煙是NIP發(fā)病的高危因素，戒煙對預(yù)防NIP發(fā)生及惡變可能有一定的臨床意義。

綜上所述，COX-2蛋白在NIP及其惡變組織中表達上調(diào)，可能與NIP的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。通過對COX-2的深入研究，尋找判斷NIP發(fā)生、發(fā)展及惡變的可靠證據(jù)，可望為NIP的化學(xué)預(yù)防和靶向治療提供新的策略和途徑。

［1］Telliez A，F(xiàn)urman C，Pommery N，et al.Mechanisms leading to COX-2 expression and COX-2 induced tumorigenesis：topical therapeutic strategies targeting COX-2 expression and activity ［J］.Anticancer Agents Med Chem，2006，6（3）：187-208.

［2］張羅，韓德民，張盛忠，等.鼻腔鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2008，15（10）：599-604.

［3］Mirza S，Bradley PJ，Acharya A，et al.Sinonasal inverted papillomas：recurrence，and synchronous and metachronous malignancy［J］.Laryngol Otol，2007，121（9）：857-864.

［4］Roh HJ，Procop GW，Batra PS，et al.Inflammation and the pathogenesis of inverted papilloma［J］.Am J Rhinol，2004，18（2）：65-74.

［5］Zafirellis K，Agrogiannis G，Zachaki A，et al.Prognostic value of COX-2 immunohistochemical expression evaluated by quantitative image analysis in col-orectal cancer［J］.APMIS，2008，116（10）：912-922.

［6］楊立，覃剛，王力紅，等.環(huán)氧化酶2及其抑制劑與頭頸部鱗狀細胞癌［J］.國際頭頸耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2007，31（3）：166-169.

［7］Khan Z，Khan N，Tiwari RP，et al.Biology of Cox-2：an application in cancer therapeutics［J］.Curr Drug Targets，2011，12 （7）：1082-1093.

［8］Huang RY，Chen GG.Cigarette smoking，cyclooxygenase-2 pathway and cancer［J］.Biochim Biophy Acta，2011，1815（2）：158-169.