孫曉紅，孟秀君，徐楓，董玉霞，何悅，侯琳琳

（中國醫(yī)科大學 1.附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110032；2.第95期臨床醫(yī)學系，沈陽 110001）

米氮平對抑郁癥大鼠海馬凋亡相關(guān)蛋白表達的調(diào)節(jié)作用

孫曉紅1，孟秀君1，徐楓2，董玉霞1，何悅1，侯琳琳1

（中國醫(yī)科大學 1.附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110032；2.第95期臨床醫(yī)學系，沈陽 110001）

目的研究米氮平對抑郁癥大鼠模型學習記憶、海馬凋亡蛋白Caspase-3和凋亡抑制蛋白Bcl-2異常表達的調(diào)節(jié)作用。方法 將20只大鼠隨機分為對照組、抑郁組和治療組，制備抑郁癥模型及米氮平治療模型，采用Morris水迷宮實驗方法評價學習記憶，應用蛋白免疫印跡雜交方法分析海馬Caspase-3蛋白和Bcl-2蛋白表達變化。結(jié)果 與對照組比較，抑郁組大鼠在水迷宮實驗目標象限內(nèi)游動時間顯著減少（P＜0.01），海馬Caspase-3蛋白表達水平顯著增高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。治療組大鼠在水迷宮實驗目標象限內(nèi)游動時間較抑郁組增加，海馬Caspase-3蛋白表達水平較抑郁組降低，Bcl-2蛋白表達水平較抑郁組升高（P均<0.05）。結(jié)論抑郁癥大鼠學習記憶力下降、海馬Caspase-3蛋白異常高表達、海馬Bcl-2蛋白異常低表達，米氮平使抑郁癥大鼠學習記憶力、海馬Caspase-3蛋白表達、海馬Bcl-2蛋白表達逆轉(zhuǎn)。

米氮平；海馬；Caspase-3；Bcl-2

抑郁癥發(fā)病率逐年提高，對抑郁癥發(fā)病機制及治療方法的研究將有助于減輕社會負擔，改善人群生存質(zhì)量。抑郁癥患者尸檢研究提示海馬等腦功能區(qū)存在結(jié)構(gòu)及功能改變［1］。最新研究發(fā)現(xiàn)，除了誘導神經(jīng)元凋亡的功能外，凋亡蛋白Caspase-3是神經(jīng)元突觸長時程抑制誘導所必需的［2］。本實驗通過構(gòu)建抑郁癥大鼠模型，研究抑郁癥大鼠學習記憶和海馬中參與神經(jīng)元存活和突觸可塑性調(diào)節(jié)的凋亡蛋白Caspase-3及其抑制蛋白Bcl-2的表達變化，研究米氮平這種具有5-羥色胺和去甲腎上腺素雙重再攝取抑制作用的新型抗抑郁藥對其產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

20只雌性成年SD大鼠，體質(zhì)量180～200g，清潔級，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。大鼠自由進食水、常溫、正常晝夜節(jié)律下飼養(yǎng)1周以適應環(huán)境。用數(shù)字表法隨機分為3組：對照組（n=4）、抑郁組（n=8）和治療組（n=8）。

1.2 模型制備

對照組大鼠合養(yǎng)，不給予任何應激刺激和藥物治療。抑郁組和治療組大鼠孤養(yǎng)，并給21d慢性不可預見性應激刺激［3］，包括束縛應激、斜籠 30°、晝夜顛倒、禁食、禁水、夾尾5min、濕墊料、冰水游泳10min等。給予慢性應激刺激的同時，抑郁組大鼠每日口飼生理鹽水（2mL/kg），治療組大鼠每日口飼米氮平鹽溶液（2mL/kg）。米氮平標準品，由華裕制藥有限公司提供。

1.3 Morris水迷宮實驗

造模18～21d，進行Morris水迷宮（Morris water maze，MWM）實驗測試大鼠空間學習及記憶能力。MWM是一個內(nèi)壁黑色，直徑150cm、高50cm的圓形水池，水溫（26±1）℃。水池分為 SW、NW、SE 和NE 4個象限，NE象限正中放置1個透明平臺，平臺頂距水面1cm。迷宮上方安裝有攝像頭，同步記錄大鼠游動軌跡。實驗歷時5d［4］，第1天為訓練適應過程；第2、3、4天將大鼠面向池壁入水，記錄120s內(nèi)大鼠尋找并爬上透明平臺所需時間即逃避潛伏期；第5天，撤走平臺，記錄120s內(nèi)大鼠穿越平臺所在位置的次數(shù)及在NE象限內(nèi)游動時間（用游動時間/總時間表示）。

1.4 Western blot檢測

MWM實驗12h后用戊巴比妥經(jīng)腹腔深麻醉，斷頭取腦，于冰上快速剝離海馬組織，提取蛋白，采用Bradford法定量蛋白濃度。采用Western blot方法檢測大鼠海馬組織Caspase-3和Bcl-2蛋白的表達量，每孔上樣量為50μg，進行12%SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1h，加入一抗?jié)舛确謩e為1/300和1/200，4℃過夜，洗膜，加入HRP標記的山羊抗兔IgG作用2h，ECL顯色，發(fā)光成像儀取像。以β-actin蛋白做為內(nèi)參校正Caspase-3和Bcl-2蛋白表達量。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 MWM實驗結(jié)果

實驗第5天，大鼠穿越透明平臺的次數(shù)組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。大鼠在NE象限內(nèi)游動時間對照組（0.46±0.01）、抑郁組（0.19±0.01）和治療組（0.35±0.05）組間存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。多重比較發(fā)現(xiàn)抑郁組大鼠在NE象限游動時間較對照組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；治療組大鼠在NE象限內(nèi)游動時間較抑郁組增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而治療組和對照組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。提示抑郁癥模型大鼠學習記憶受損，而米氮平治療改善大鼠在水迷宮實驗中的行為表現(xiàn)。

2.2 Western blot檢測結(jié)果

Western blot檢測結(jié)果見圖1，單因素方差分析顯示組間有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。多重比較發(fā)現(xiàn)抑郁組海馬Caspase-3蛋白相對表達量高于對照組和治療組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），抑郁組海馬Bcl-2蛋白相對表達量低于對照組和治療組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而對照組和治療組間海馬Caspase-3和Bcl-2蛋白相對表達量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表1。提示抑郁癥模型大鼠凋亡相關(guān)蛋白異常表達，米氮平治療則可逆轉(zhuǎn)這種異常表達。

表13組C a s p a s e-3和B c l-2蛋白表達比較（±s）T a b.1N o r ma l i z e dl e v e l s o f c a s p a s e-3a n db c l-2p r o t e i ni nt h er a t h i p p o c a mp i（±s）Group Caspase-3expression Bcl-2expression Control group 0.87±0.01 1.38±0.02Depression group 1.10±0.071），2） 0.88±0.131），2）Treatment group 0.92±0.06 1.21±0.021）P ＜ 0.05vs control group；2）P ＜ 0.05vs treatment group.

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，米氮平治療后大鼠在水迷宮實驗中的抑郁樣行為明顯改善，顯示出對異常高表達的Caspase-3蛋白和低表達的Bcl-2蛋白具有調(diào)節(jié)作用。

近年來，臨床研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者有不同程度海馬依賴的記憶功能受損表現(xiàn)［5］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑郁組大鼠在NE象限游動時間較對照組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示抑郁組大鼠學習記憶受損，可能由于海馬參與短期記憶的形成以及短期記憶到長期記憶的轉(zhuǎn)換受到抑制［6］，而治療組和對照組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），提示米氮平治療對海馬記憶功能有一定的改善作用。

另有臨床研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者出現(xiàn)海馬萎縮，可能與神經(jīng)元凋亡、樹突重構(gòu)有關(guān)［7］。Caspase-3蛋白及其活性形式存在于海馬正常神經(jīng)元內(nèi)，為神經(jīng)元長時程抑制誘導所必需，介導快速興奮性突觸傳遞［2］。Caspase-3蛋白的DNA片段在抑郁癥患者海馬內(nèi)表達增加［8］。提示海馬內(nèi)高表達的Caspase-3蛋白可能通過可塑性途徑參與海馬萎縮及樹突棘丟失。

Bcl-2蛋白有抑制凋亡蛋白活性的作用［3］，對神經(jīng)元具有類似神經(jīng)營養(yǎng)因子的保護作用［9］。本實驗結(jié)果顯示：抑郁組海馬Bcl-2蛋白表達量低于對照組和治療組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而對照組和治療組間海馬Bcl-2蛋白表達量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），與文獻報道的抑郁癥大鼠模型中海馬Bcl-2mRNA表達下降，抗抑郁治療上調(diào)海馬Bcl-2蛋白免疫雜交量的結(jié)論［10］一致。

綜上所述，我們認為Caspase-3蛋白高表達而Bcl-2蛋白低表達，可能是引起海馬結(jié)構(gòu)和功能改變的原因之一，而治療組海馬Caspase-3和Bcl-2蛋白表達與對照組無統(tǒng)計學差異，提示抗抑郁藥可能影響細胞凋亡的Caspase-3和Bcl-2蛋白表達，促進神經(jīng)纖維網(wǎng)的修復。

［1］Czéh B，Lucassen PJ.What causes the hippocampal volume decrease in depression?Are neurogenesis，glial changes and apoptosis implicated?［J］.Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci，2007，257（5）：250-260.

［2］Li Z，Jo J，Jia JM，et al.Caspase-3activation via mitochondria is required for long-term depression and AMPA receptor internalization［J］.Cell，2010，141（5）：859-871.

［3］Willner P.Chronic mild stress（CMS）revisited：consistency and behavioral neurobiological coincordance in the effects of CMS［J］.Neuropsychobiology，2005，52（2）：90-110.

［4］Christianson JP，Drugan RC.Intermittent cold water swim stress increases immobility and interferes with escape performance in rat［J］.Behavi Brain Res，2005，165（1）：58-62.

［5］Campbell S，Macqueen G.The rool of the hippocampus in the pathophysiology of major depression ［J］.J Psychiatry Neurosci，2004，29（6）：417-426.

［6］Morris RG，Moser EI，Riedel G，et al.Elements of a neurobiological theory of the hippocampus：the role of activity-dependent synaptic plasticity in memory［J］.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2003，358（1432）：773-786.

［7］Bateup HS，Sabatini BL.For synapses，it′s depression not death［J］.Cell，2010，141（3）：750-752.

［8］Lucassen PJ，Muller MB，Holsboer F，et al.Hippocampal apoptosis in major depression is a minor event and absent from subareas at risk for glucocorticoid overexposure［J］.Am J Pathol，2001，158（2）：453-468.

［9］Benninghoff J.Stem cell approaches in psychiatry-challenges and opportunities［J］.Dialogues Clin Neurosci，2009，11（4）：397-404.

［10］Xu H，Richardson JS，Li XM.Dose-related effects of chronic antidepressants on neuroprotective proteins BDNF，Bcl-2and Cu/Zn-SOD inrathippocampus［J］.Neuropsychopharmacology，2003，28（1）：53-62.

（編輯武玉欣，英文編輯劉寶林）

The Effects of Mirtazapine on the Expression of Hippocampal Apoptotic Proteins in the Rat Depression Model

SUN Xiao-hong1，MENG Xiu-jun1，XU Feng2，DONG Yu-xia1，HE Yue1，HOU Lin-lin1
（1.Department of Neurology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110032，China；2.The 95th Class，F(xiàn)aculty of Clinical Medicine，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effects of mirtazapine on learning and memory and on the expression of hippocampal Caspase-3and Bcl-2protein in rat depression model.MethodsRats were divided into control，depression and treatment group.Depression model and mirtazapine treatment model were prepared，followed by Morris water maze test to evaluate learning and memory，and western blot to assess hippocampal Caspase-3and Bcl-2protein expression.ResultsRats in the depression group showed significantly reduced swim time spent in the targeted quadrant of the morris water maze，elevated Caspase-3protein levels，and decreased Bcl-2protein levels.ConclusionDepression model rats showed impaired learning and memory，abnormal expression of hippocampal Caspase-3and Bcl-2protein，while mirtazapine attenuated the abnormalities.

mirtazapine；hippocampi；Caspase-3；Bcl-2

R341.32

A

0258-4646（2012）01-0008-03

doiCNKI：21-1227/R.20120113.1027.023

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20120113.1027.023.html

國家自然科學基金資助項目（30700220）；遼寧省教育廳高?？蒲杏媱潱↙2010587）；遼寧省博士啟動基金項目（20081057）

孫曉紅（1972-），女，教授，博士后.E-mail：sunxiaohong1972@hotmail.com

2011-07-14

網(wǎng)絡出版時間：2012-01-1310：27