臧文霞，王 菁，韓長日，陳光英，羅成果，吉如倩

(海南師范大學熱帶藥用植物化學省部共建重點實驗室，?？?71158)

天然藥物的研究與開發(fā)已成為人類尋找新藥以及對抗疾病的重要手段。長期以來，作為海南特有植物的白千層、大果榕、山蒼子、匍匐濱藜、牛大力，在海南黎族地區(qū)作為藥物用于多種疾病的治療。2011年6月10日～7月23日，我們觀察了白千層、大果榕、山蒼子、匍匐濱藜、牛大力的萃取物對人肺腺癌細胞(SPCA-1)、肝癌細胞(BEL-7402)、胃癌細胞(GSC-7901)和白血病細胞(K562)的體外增殖抑制作用，抑制率超過50%即被確定為抗腫瘤有效活性萃取部位(活性萃取部位:具有抗腫瘤活性的植物乙醇提取物的不同極性有機溶劑萃取物)，測定有效活性萃取部位的半數(shù)抑制率(IC50)。為進一步研究此五種植物的抗腫瘤作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 高壓滅菌鍋，倒置顯微鏡，ELx800酶標儀，CO2恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺，可調式移液器，96孔細胞培養(yǎng)板，電子天平。

1.2 材料 RPMI1640培養(yǎng)液，胰酶，MTT，超級新生牛血清，二甲基亞砜(DMSO)。百千層、大果榕、山蒼子、匍匐濱藜、牛大力采自海南，由海南師范大學生命科學學院進行鑒定，其標本保存于海南省熱帶藥用植物化學重點實驗室。

1.3 細胞株 細胞株 SPCA-1、BEL-7402、GSC-7901、K562由南方醫(yī)科大學提供，常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 樣品制備 取白千層葉粗粉7.5 kg，75%乙醇水浴回流4 h，提取3次，合并濾液，旋轉蒸發(fā)儀回收溶劑，所得浸膏加水溶解，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，將萃取物溶劑回收并制成凍干粉，即得粗提物。分別取大果榕的根、莖、葉粗粉1 kg，用95%乙醇分3次回流12 h，旋轉蒸發(fā)儀回收溶劑，所得浸膏加水溶解，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇萃取，回收溶劑凍干處理，4℃儲存?zhèn)溆?。分別取山蒼子葉、枝干粉10 kg，95%閃式提取器提取1次，旋轉蒸發(fā)儀回收溶劑，浸膏加水溶解，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，將萃取物及萃取后剩余水層回收溶劑制成凍干粉，分別得到氯仿、石油醚、乙酸乙酯、水的提取物。取匍匐濱藜全株粗粉7.5 kg，95%乙醇水浴回流提取3次，每次5 h，合并濾液，旋轉蒸發(fā)儀回收溶劑，所得浸膏加水溶解，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，將萃取物及萃取后剩余水層回收溶劑制成凍干粉，即得粗提物。取牛大力根部粗粉35 kg，95%乙醇水浴回流提取3次，每次4 h，合并濾液，旋轉蒸發(fā)儀回收溶劑，所得浸膏加水溶解，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，萃取物回收溶劑凍干，得粗提物。以上浸膏均以50%DMSO為溶劑，精確配制成10 mg/mL供試樣儲備液，使用時用PBS稀釋。

1.5 藥物活性初篩 給藥組將SPCA-1、BEL-7402、GSC-7901、K562細胞分別以2×104/mL、7×104/ mL、4×104/mL、1×104/mL接種于96孔板，每孔180 μL，在CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)8～12 h，待細胞貼壁后，加入濃度為100 μg/mL的不同植物粗提物各20 μL，終體積200 μL。加藥細胞培養(yǎng)44 h后，每孔加入MTT溶液(1 mg/mL)50 μL［1，2］，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出后去上清，每孔加入150 μL的DMSO，避光振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm測定各孔的光密度值(OD值)。同時設空白組(加入不含細胞的培養(yǎng)液，檢驗培養(yǎng)基是否感染雜菌)和對照組(加入含有細胞的培養(yǎng)液及藥物溶劑)。計算細胞增殖抑制率，根據(jù)抗腫瘤藥物療效的評價標準之一［3］，設定抑制率＞50%為抗腫瘤有效活性萃取部位，細胞增殖抑制率=(對照組OD值－給藥組OD值)/對照組OD值×100%。每份樣本平行測定5孔，取均值。

1.6 IC50測算 根據(jù)藥物活性初篩所得數(shù)據(jù)，選取有細胞增殖抑制活性(濃度為100 μg/mL時細胞增殖抑制率＞50%)的樣品，稀釋成不同濃度(1、10、100 μg/mL)，進行二次MTT實驗(實驗方法同上)，并計算IC50:以同一樣品的濃度對數(shù)值為橫坐標，以細胞增殖抑制率為縱坐標，作回歸曲線，計算IC50。1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。組間比較用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 五種植物經(jīng)初篩具有抗腫瘤活性的萃取部位對GSC-7901細胞的增殖抑制作用及其IC50五種植物中經(jīng)初篩對GSC-7901細胞具有抗腫瘤活性的分別為白千層石油醚和氯仿萃取物、大果榕氯仿萃取物、山蒼子石油醚和氯仿萃取物(細胞增殖抑制率在65%以上)，其對GSC-7901細胞增殖的影響見表1。IC50分別為白千層石油醚萃取物23.50 μg/ mL、氯仿萃取物41.15 μg/mL，大果榕氯仿萃取物37.36 μg/mL，山蒼子石油醚萃取物117.67 μg/mL、氯仿萃取物173.66 μg/mL。

表1 白千層、大果榕、山蒼子的活性萃取部位對GSC-7901細胞增殖的影響

2.2 五種植物經(jīng)初篩具有抗腫瘤活性的萃取部位對SPCA-1細胞的增殖抑制作用及其IC50五種植物中經(jīng)初篩對SPCA-1細胞具有抗腫瘤活性的分別為白千層石油醚萃取物、大果榕石油醚萃取物、山蒼子石油醚萃取物和牛大力的乙酸乙酯萃取物(細胞抑制率在55%以上)，其對SPCA-1細胞增殖的影響見表2。IC50分別為白千層石油醚萃取物45.17 μg/ mL，大果榕石油醚萃取物55.89 μg/mL，山蒼子石油醚萃取物213.70 μg/mL，牛大力乙酸乙酯萃取物38.77 μg/mL。

表2 白千層、大果榕、山蒼子、牛大力的活性萃取部位對SPCA-1細胞增殖的影響

2.3 五種植物經(jīng)初篩具有抗腫瘤活性的萃取部位對K562細胞的增殖抑制作用及其IC50五種植物中經(jīng)初篩對K562細胞具有抗腫瘤活性的分別為大果榕石油醚和氯仿萃取物、山蒼子石油醚和氯仿萃取物、牛大力氯仿萃取物(細胞抑制率在50%以上)，其對K562細胞增殖的影響見表3(二次MTT實驗時大果榕的石油醚萃取物、山蒼子氯仿萃取物對K562細胞增值抑制率略低于50%，是因細胞培養(yǎng)批次不同、密度不同所致)。IC50分別為大果榕石油醚萃取物91.61 μg/mL、氯仿萃取物39.29 μg/ mL，山蒼子石油醚萃取物9.66 μg/mL、氯仿萃取物65.93 μg/mL，牛大力氯仿萃取物56.50 μg/mL。

2.4 五種植物經(jīng)初篩具有抗腫瘤活性的萃取部位對BEL-7402細胞的增殖抑制作用及其IC50五種植物中經(jīng)初篩對BEL-7402具有抗腫瘤活性的分別為白千層石油醚萃取物、山蒼子石油醚和氯仿萃取物、匍匐濱藜乙酸乙酯萃取物(細胞抑制率在50%以上)，其對K562細胞增殖的影響見表4。IC50分別為白千層石油醚萃取物35.61μg/mL，山蒼子石油醚萃取物104.82 μg/mL、氯仿萃取物34.05 μg/ mL，匍匐濱藜乙酸乙酯萃取物52.98 μg/mL。

表3 大果榕、山蒼子、牛大力的活性萃取部位對K562細胞增殖的影響

表4 白千層、山蒼子、匍匐濱藜的活性萃取部位對K562細胞增殖的影響

3 討論

從白千層的葉和樹枝中能夠分離得到具有防腐、殺菌、防霉等作用的白千層油［4］。大果榕，俗稱無花果，為?？崎艑?。山蒼子的根、莖、葉和果實均可入藥，有抗血栓、抗哮喘和抗過敏功效［5］。匍匐濱藜可用于治療風濕痹痛、帶下、月經(jīng)不調、瘡瘍癰疽、皮炎。牛大力具有保肝、祛痰、鎮(zhèn)咳、平喘、提高免疫功能等作用［6］。這五種植物中可能含有生物堿類［7］、萜類、多酚類［8］及其他具有抗癌活性的成分。

本研究結果顯示，白千層的石油醚萃取物、大果榕的氯仿萃取物對GSC-7901細胞有較好的增殖抑制作用，其濃度在100 μg/mL時細胞增殖抑制率可達75%以上，IC50＜40 μg/mL。白千層的氯仿萃取物、山蒼子的石油醚和氯仿萃取物對GSC-7901細胞的抑制作用較弱。活性部位對SPCA-1細胞的增殖抑制作用呈劑量依賴性。其余萃取物對GSC-7901細胞的增殖抑制作用不明顯。

白千層的石油醚萃取物、牛大力的乙酸乙酯萃取物對SPCA-1細胞的增殖有較好的抑制作用，其濃度在100 μg/mL時細胞增殖抑制率可達75%以上，IC50＜46 μg/mL。大果榕的石油醚萃取物、山蒼子的石油醚萃取物對SPCA-1細胞的增殖抑制作用較弱;活性部位對SPCA-1細胞的增殖抑制作用呈劑量依賴性。其余萃取物對SPCA-1細胞的增殖抑制作用不明顯。

大果榕的氯仿萃取物、山蒼子的石油醚萃取物、牛大力的氯仿萃取物對K562細胞的增殖有較好的抑制作用，其濃度在100 μg/mL時細胞增殖抑制率可達60%以上，IC50＜60 μg/mL，其中山蒼子石油醚萃取物的IC50達到9.66 μg/mL。其余萃取物對K562細胞的增殖抑制作用不明顯。

白千層的石油醚萃取物對BEL-7402細胞的增殖有較好的抑制作用，其濃度在100 μg/mL時細胞增殖抑制率可達80%以上，IC50＜40 μg/mL。山蒼子的石油醚和氯仿萃取物、匍匐濱藜的乙酸乙酯萃取物對BEL-7402細胞顯示了較弱的抑制作用?；钚圆课粚θ烁伟┘毎囊种谱饔贸蕜┝恳蕾囆?，其余萃取物對BEL-7402細胞的增殖抑制作用不明顯。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，白千層的石油醚萃取物對GSC-7901細胞及山蒼子的石油醚萃取物對K562細胞有很好的抑制作用，其IC50＜30 μg/mL，且其對腫瘤細胞的毒性呈劑量依賴關系。文獻［9］報道，腫瘤藥物敏感實驗的體外實驗結果與體內化療療效總符合率達85%。接下來我們將針對這五種植物中活性萃取部位較好的幾種植物進行活性成分分析，確定其有效物質成分。

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