魏 群 李煥明 劉 勇 顧乃剛 張 寰 (天津醫(yī)科大學(xué)第四中心臨床學(xué)院，天津 300140)

激活素A和卵泡抑素對(duì)大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原沉積的影響

魏 群 李煥明 劉 勇 顧乃剛 張 寰 (天津醫(yī)科大學(xué)第四中心臨床學(xué)院，天津 300140)

目的探討激活素A(Activin A)和卵泡抑素(FS)對(duì)體外培養(yǎng)的原代大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原沉積的影響。方法取出生24 h內(nèi)Wistar乳鼠心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別向培養(yǎng)液中加入Activin A或FS+Activin A。應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，應(yīng)用化學(xué)比色法檢測(cè)培養(yǎng)液上清羥脯氨酸含量，RT-PCR法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)和Ⅲ型膠原(Col-Ⅲ)mRNA表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，不同濃度Activin A組心肌成纖維細(xì)胞的OD值及羥脯氨酸含量明顯增高(P＜0.05～0.01)，Col-Ⅰ及Col-ⅢmRNA表達(dá)水平明顯升高。不同濃度FS組可降低心肌成纖維細(xì)胞的OD值及羥脯氨酸含量(P＜0.05～0.01)，下調(diào)Col-Ⅰ及Col-ⅢmRNA表達(dá)水平。結(jié)論Activin A能夠促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原沉積，提示Activin A可能在心肌間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，F(xiàn)S能夠拮抗Activin A誘導(dǎo)的心肌間質(zhì)纖維化。

激活素A;卵泡抑素;心肌成纖維細(xì)胞;心肌間質(zhì)纖維化

激活素A(Activin A)屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族成員之一，與急性期應(yīng)答以及纖維化形成有關(guān)〔1〕。一定程度的Activin A表達(dá)有助于損傷修復(fù)過(guò)程正常進(jìn)行，但其過(guò)度表達(dá)則可能與器官纖維化及某些慢性纖維化疾病的形成有關(guān)。卵泡抑素(FS)作為激活素特異結(jié)合蛋白，與Activin A有高度的親和力，可以阻斷激活素的生物學(xué)作用。Activin A與FS形成Activin A-FS系統(tǒng)共同參與調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察Activin A對(duì)體外培養(yǎng)原代大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原沉積的影響，探討Activin A和FS在心肌間質(zhì)纖維化中的作用，闡明心肌間質(zhì)纖維化的可能發(fā)病機(jī)制，為防治心肌纖維化提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 出生24 h內(nèi)的Wistar乳鼠，購(gòu)自天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基(DF，Hyclone公司)，重組人Activin A、FS(美國(guó)Peprotech公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，青霉素、鏈霉素(華北制藥廠)，四甲基耦氮唑鹽(MTT，Amersha公司)，Trizol RNA提取液、RT-PCR試劑盒(Takara公司)，羥脯氨酸測(cè)定試劑盒由南京建成提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取出生24 h內(nèi)的Wistar乳鼠10只，75%酒精消毒皮膚，無(wú)菌開(kāi)胸剪取心臟，將心臟放入盛有預(yù)冷D-Hank液的平皿中，剔除心耳及大血管，冷D-Hank液沖洗心室3次，將心室肌剪成1mm3大小的碎塊，加10ml0.08%胰酶，35℃ ～37℃反復(fù)消化，每次5 min，收集歷次的消化上清，加入小牛血清終止消化，離心2次，1 200 r/min，5 min，細(xì)胞沉淀用20%血清DMEM培養(yǎng)液混懸，37℃、5%CO2培養(yǎng)60 min后棄上清，瓶?jī)?nèi)貼壁細(xì)胞即為心肌成纖維細(xì)胞。后以10%血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞80%長(zhǎng)滿時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶消化，血清終止，1 200 r/min，5 min離心洗去胰酶，加入培養(yǎng)液重懸，1∶2傳代。后應(yīng)用抗波形蛋白單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定心肌成纖維細(xì)胞純度達(dá)98%。試驗(yàn)采用2～3代的心肌成纖維細(xì)胞。

1.2.2 Activin A和FS對(duì)原代大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和羥脯氨酸分泌的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×105個(gè)/m l，接種于96孔板，0.1 ml/孔，培養(yǎng)24 h后更換10%血清DMEM培養(yǎng)24 h，隨后將細(xì)胞分為:(1)control組;(2)A組:Activin A 10 ng/ml;(3)B組:Activin A 30 ng/ml;(4)C組:Activin A 50 ng/m l;(5)D組:Activin A 100 ng/m l;(6)E組:FS 10 ng/ml+Activin A 10 ng/m l;(7)F組:FS 30 ng/m l+Activin A 30 ng/m l;(8)G組:FS 50 ng/ml+Activin A 50 ng/ml;(9)H組:FS 100 ng/m l+Activin A 100 ng/ml。每組6復(fù)孔，各組細(xì)胞加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用藥后第24小時(shí)各孔吸取培養(yǎng)液，用于測(cè)定羥脯氨酸含量，后加入15μl5 mg/mlMTT，4 h后各孔加入100μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻 10 min，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞Col-Ⅰ和Col-Ⅲ mRNA表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同上，加入藥品后再繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)用TRIzol試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，取總RNA 1μg行逆轉(zhuǎn)錄后取5μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參照，對(duì) Col-Ⅰ 及Col-Ⅲ mRNA表達(dá)進(jìn)行半定量檢測(cè)。引物序列由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。β-actin正義引物序列:5'-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3'，反義引物序列:5'-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3'，片段長(zhǎng)度359 bp;Col-Ⅰ正義引物序列:5'-AGGGTCATCGTGGCTTCTC-3'，反義引物序列:5'-ACCTTCGCTTCCATACTCG-3'，片段長(zhǎng)度361 bp;Col-Ⅲ正義引物序列:5'-CTCAAGAGCGGAGAATACTGG-3'，反義引物序 列:5'-TGCCACCATCATAGACTAGATTC-3'，片 段 長(zhǎng) 度704 bp。PCR反應(yīng):取3μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性90 s，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸50 s，循環(huán)32次，最后72℃延伸10 min。取5μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳，光密度掃描后圖片經(jīng)Image J軟件分析，結(jié)果以檢測(cè)蛋白/β-actin的光密度比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Activin A對(duì)原代大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響 與Control組相比，Activin A對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用，在50 ng/m l以內(nèi)呈劑量依賴性。當(dāng)其濃度達(dá)100 ng/ml時(shí)，仍有促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖的作用，高于對(duì)照組(P＜0.01)，但增殖效應(yīng)減弱。FS能拮抗Activin A對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，呈劑量依賴性(P＜0.05～0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 Activin A促進(jìn)原代大鼠心肌成纖維細(xì)胞羥脯氨酸分泌的影響 與Control組相比，不同劑量Activin A組的羥脯氨酸含量明顯增加(P＜0.05～0.01)，表明給予Activin A后可引起心肌成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)膠原分泌;與不同劑量Activin A組相比，F(xiàn)S 10、30、50、100 ng/ml能降低心肌成纖維細(xì)胞羥脯氨酸含量(P＜0.05～0.01)。見(jiàn)表1。

表1 Activin A及FS對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖及羥脯氨酸分泌的影響(±s，n=6)

表1 Activin A及FS對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖及羥脯氨酸分泌的影響(±s，n=6)

與control組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與A組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 OD值 培養(yǎng)液上清羥脯氨酸含量(μg/ml)control組0.088±0.012 4.01±0.13 A組 0.143±0.0112) 6.47±0.151)B組 0.165±0.0102) 7.98±0.162)C組 0.186±0.0112) 8.91±0.122)D組 0.190±0.0152) 9.16±0.152)E組 0.134±0.0143) 5.98±0.143)F組 0.121±0.0174) 5.45±0.174)G組 0.098±0.0104) 4.86±0.104)H組 0.097±0.0114) 5.14±0.114)

圖1 各組心肌細(xì)胞Col-Ⅰ及Col-ⅢmRNA的表達(dá)

2.3 Activin A對(duì)心肌成纖維細(xì)胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ mRNA表達(dá)水平的影響 如圖1所示，與control組相比，不同劑量Activin A組心肌成纖維細(xì)胞Col-Ⅰ及Col-Ⅲ mRNA表達(dá)水平明顯增高，以Activin A 50 ng/ml劑量最顯著。與不同劑量Activin A組相比，F(xiàn)S 10、30、50、100 ng/ml能下調(diào)心肌成纖維細(xì)胞 Col-Ⅰ及Col-Ⅲ mRNA表達(dá)。

3 討論

心室重構(gòu)是慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)。在分子水平上，心室重構(gòu)既包括心肌細(xì)胞的重構(gòu)，又包括心肌間質(zhì)的膠原沉積和纖維化〔2〕。其中膠原合成與表達(dá)(包括Ⅰ、Ⅲ型膠原)的增多及在心肌間質(zhì)內(nèi)聚集是心肌纖維化的重要表現(xiàn)〔3〕。已發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞因子參與心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制，其中以血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)及TGF-β1的作用最強(qiáng)。Activin A屬于TGF-β超家族成員，研究表明一定程度的Activin A表達(dá)有助于損傷修復(fù)過(guò)程正常進(jìn)行，但其過(guò)度表達(dá)則可能與器官纖維化及某些慢性纖維化疾病的形成有關(guān)。Yndestad等〔4〕研究顯示心梗后心衰模型左室缺血區(qū)及非缺血區(qū)Activin A表達(dá)水平明顯增高，可以誘導(dǎo)與心肌重塑相關(guān)的介質(zhì)如心鈉素(ANP)、腦鈉素(BNP)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9等mRNA表達(dá)增加，而且上述因子在間質(zhì)纖維化的發(fā)展過(guò)程中起重要作用。新近實(shí)驗(yàn)證明在心肌缺血/再灌注損傷中心肌組織Activin A表達(dá)亦增強(qiáng)〔5〕。這些均提示Activin A在細(xì)胞增殖分化、纖維化及損傷修復(fù)過(guò)程中都具有重要作用，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的合成具有促進(jìn)作用。FS是Activin A的天然結(jié)合蛋白，具有廣泛的組織分布，與Activin A有很高的親和力，而且FS與Activin A之間的結(jié)合幾乎是不可逆的，從而阻斷Activin A的生物活性〔6〕。

本實(shí)驗(yàn)向體外培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中加入外源性的Activin A，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Activin A在10～50 ng/ml范圍內(nèi)呈劑量依賴性地刺激心肌成纖維細(xì)胞增殖;當(dāng)Activin A濃度達(dá)100 ng/m l時(shí)，仍具有刺激成纖維細(xì)胞增殖的作用，但作用已減弱，說(shuō)明在一定的濃度范圍內(nèi)Activin A對(duì)心肌成纖維細(xì)胞具有刺激增殖作用。另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在RNA水平，Activin A能夠促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞Col-Ⅰ及Col-Ⅲ mRNA表達(dá)及羥脯氨酸分泌。說(shuō)明Activin A能夠促進(jìn)心肌間質(zhì)膠原沉積，與心肌間質(zhì)纖維化密切相連，這為闡明心衰的發(fā)病機(jī)制提供了新的方向。FS能夠抑制Activin A誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的增殖、羥脯氨酸的分泌，下調(diào)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ mRNA水平表達(dá)。

總之，Activin A可能通過(guò)促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞Col-Ⅰ和Col-ⅢmRNA表達(dá)及羥脯氨酸分泌，參與了心肌纖維化進(jìn)程。Activin A可能是導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維化的又一重要細(xì)胞因子，是改善心衰的新的治療靶點(diǎn)。而FS通過(guò)與Activin A不可逆結(jié)合，抑制了Activin A的作用，F(xiàn)S在未來(lái)有可能成為改善心衰的新的藥物。

1 Werner S，Alzheimer C.Roles of activin in tissue repair，fibrosis，and inflammatory disease〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev，2006;17(3):157-71.

2 Zile MR，Brutsaert DL.New concepts in diastolic dysfunction and dias-tolic heart failure:PartⅡ:.causalmechanisms and treatment〔J〕.Circulation，2002;105(2):1503-8.

3 Yang F，Yang XP，Liu YH，et al.Ac-SDKP reverses inflammation and fibrosis in ratswith heart failure aftermyocardial infarction〔J〕.Hypertension，2004;43(2):229-36.

4 Yndestad A，Ueland T，?ie E，et al.Elevated levels of activin a in heart failure:potential role in myocardial remodeling〔J〕.Circulation，2004;109(11):1379-85.

5 Zhang LJ，Huang H，Pan PX，et al.Study on the expression of Activin-A in myocardial ischemia postconditioning〔J〕.Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2009;40(1):97-9.

6 Shimonaka M，Inouye S，Shimasaki S，et al.Follistatin binds to both activin and inhibin through the common subunit〔J〕.Endocrinology，1991;128(6):3313-5.

R542.2+3

A

1005-9202(2012)16-3475-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.059

天津市衛(wèi)生局面上基金資助項(xiàng)目(No.2011KY05)

張 寰(1961-)，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事冠心病介入治療。

魏 群(1970-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事心力衰竭的發(fā)病機(jī)制及治療的相關(guān)研究。

〔2012-01-20收稿 2012-04-10修回〕

(編輯 袁左鳴)