李 莉， 張俊亞， 唐遠(yuǎn)平， 宋任濤， 朱晨光

(上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院上海市能源作物育種及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200444)

苯酚是焦化廠及煉油廠污水的主要有機(jī)污染物.近30年的研究表明，許多微生物參與此類有機(jī)物的降解過程［1］，苯酚的生物降解已成為一種經(jīng)濟(jì)高效且不會(huì)產(chǎn)生二次污染的方法［2］.降酚微生物基因組中存在多個(gè)與降酚相關(guān)的基因，組合形成操作元，一起調(diào)控微生物降解苯酚.目前，苯酚的好氧降解途徑已被解析，步驟如下：苯酚加氧變?yōu)猷彵蕉?，再分別由鄰位或間位途徑環(huán)裂解，鄰位途徑產(chǎn)生β-一酮基己二酸中間產(chǎn)物，間位途徑產(chǎn)生α-一酮基己二酸中間物，兩種路徑都形成丙酮酸，而后進(jìn)入三羧酸循環(huán).

Cupriavidus metallidurans CH34是從污染廢水處理池的沉淀物中分離得到的一種細(xì)菌.該細(xì)菌具有較好的苯酚降解能力，還可在以甲苯酚、苯甲酸、苯胺等芳香族化合物為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng).高振賢等［3］和宋水山等［4］的研究表明，該菌種降解苯酚的速率常數(shù)為0.33，最適pH為7.0，最適溫度為30℃.CH34基因組的測(cè)序工作已于2002年9月完成，其染色體大小為3.9 Mb，含有3個(gè)大質(zhì)粒：Megaplasmid(2.6 Mb)，pMOL 28(171 kb)和pMOL 30(234 kb).

本研究利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，通過比較基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CH34基因組中存在新穎的苯酚降解基因簇結(jié)構(gòu).序列注釋分析發(fā)現(xiàn)，CH34同時(shí)具備鄰位與間位2種不同開環(huán)路徑的苯酚降解基因簇，其各自的苯酚羥化酶大亞基(LmPH)氨基酸序列在系統(tǒng)發(fā)育地位上存在較大差異，這預(yù)示著CH34可能有其獨(dú)特的苯酚降解機(jī)理和調(diào)控機(jī)制.因此，對(duì)該菌株的降酚基因簇展開深入的功能研究，不僅可以對(duì)微生物降解苯酚的分子機(jī)制起到驗(yàn)證和補(bǔ)足的作用，同時(shí)也可以為生物處理污水中的苯酚等污染物提供優(yōu)良的功能基因.本研究采用pIndigo-BAC 5載體構(gòu)建了CH34的細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)基因組文庫(kù).根據(jù)降酚基因簇LmPH的phlN基因設(shè)計(jì)引物，用PCR的方法從BAC文庫(kù)中篩選到了分別含有2個(gè)完整苯酚降解基因簇的單克隆，并分別檢測(cè)了這2個(gè)降酚基因簇在大腸桿菌中對(duì)苯酚的降解能力，為今后篩選高效的降酚基因簇和研制可應(yīng)用于環(huán)境治理的基因工程菌奠定了理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

菌株C.metallidurans CH34購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，BAC載體pIndigo-BAC 5購(gòu)于EpiCentre公司，低熔點(diǎn)瓊脂糖膠和大腸桿菌(E.coli)感受態(tài)細(xì)胞DH10B購(gòu)于Invitrogen公司，脈沖場(chǎng)凝膠電泳用Marker購(gòu)于 NEB公司，限制性內(nèi)切酶 NotⅠ，HindⅢ和 XbaⅠ購(gòu)于 Fermentas公司，Taq DNA Polymerase和dNTP購(gòu)于TaKaRa公司.

1.2 方法

1.2.1 BAC文庫(kù)的構(gòu)建

隨著大片段DNA插入技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們克服了制約BAC文庫(kù)發(fā)展的瓶頸，從而為大規(guī)模的文庫(kù)構(gòu)建及大基因組文庫(kù)的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)［5］.BAC文庫(kù)除了插入片段較大外，還具有遺傳穩(wěn)定性好、嵌合現(xiàn)象低等優(yōu)點(diǎn)［6-7］，因此，本研究試圖通過構(gòu)建CH34的BAC文庫(kù)，來研究其2個(gè)苯酚降解基因簇的功能.

首先提取高分子量的CH34基因組DNA，將DNA保存于低熔點(diǎn)瓊脂糖制備的膠塊中，膠塊保存于0.1 mol/L EDTA中，確定最佳酶切條件后，開始正式酶切.取適量的DNA進(jìn)行酶切，為得到大小更為集中的片段，一般進(jìn)行兩次脈沖場(chǎng)電泳［8］.第一次脈沖場(chǎng)電泳的條件為：1%瓊脂糖凝膠，0.5×TBE，6 V/cm電壓，90 s脈沖時(shí)間，14℃電泳16 h以分離酶切的片段.第二次脈沖場(chǎng)電泳的條件為：1%瓊脂糖凝膠，0.5×TBE，4 V/cm電壓，5 s脈沖時(shí)間，14℃電泳5 h.以分子Marker為參照，切下片段大小在100～300 kb的DNA膠塊，裝入透析袋，電洗脫得到所需的DNA片段［9］.與DNA標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度比較，確定得到的大片段DNA的濃度.以載體與目的片段摩爾比為5∶1的比例進(jìn)行連接，連接體系總體積為50 μL，連接反應(yīng)于16℃進(jìn)行約10 h，得到的連接產(chǎn)物于65℃處理15 min，以使 T4 DNA連接酶失活［10］.對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽和濃縮處理以提高轉(zhuǎn)化效率［11］，然后電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌［12］.從得到的轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)挑選96個(gè)克隆，LB液體培養(yǎng)后，通過堿裂解法抽取BAC質(zhì)粒，酶切后進(jìn)行脈沖場(chǎng)電泳，以確定插入片段的大小.

1.2.2 陽性克隆的篩選

根據(jù)CH34的2個(gè)苯酚降解基因簇的大亞基分別設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，其中用于篩選長(zhǎng)簇的引物序列為 ch1f(5'-AACGCACTCAAGGTGTTTATCCAGG-3')，ch1r(5'-GCGAAGGTCTGATGGCTGATGTG-3')，用于篩選短簇的引物序列為ch2f(5'-CCTGTCCGTGCCGAAGTCGTATTT-3')，ch2r(5'-CAGAAGTGGTAGTGCTCGCCGTTG-3').從BAC文庫(kù)中隨機(jī)挑選約3 000個(gè)克隆，通過堿裂解法抽取BAC質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖電泳，根據(jù)是否出現(xiàn)單一的目的條帶來篩選陽性克隆.

1.2.3 完整插入的陽性克隆挑選

對(duì)篩選到的5個(gè)含有長(zhǎng)簇的陽性克隆以及4個(gè)含有短簇的陽性克隆分別抽取BAC質(zhì)粒，用ScaⅠ酶切后進(jìn)行瓊脂糖電泳.根據(jù)切開的條帶大小，與2個(gè)降酚基因簇的酶切圖譜進(jìn)行對(duì)照，各自挑選一個(gè)完整插入該簇的克隆，用于后續(xù)的功能分析.

1.2.4 陽性克隆的功能分析

把2個(gè)含有長(zhǎng)短降酚基因簇的陽性克隆，分別接種到以苯酚為唯一碳源，且含有不同質(zhì)量濃度梯度苯酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，其中苯酚的質(zhì)量濃度分別為50，100，200，500，800 mg/L.每個(gè)克隆進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取平行實(shí)驗(yàn)的平均值作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).每隔24 h取一次樣，測(cè)菌液的OD600以確定菌體濃度.用改進(jìn)的4-氨基安替比啉法測(cè)定菌液中的苯酚質(zhì)量濃度［13］：取菌液離心上清液80 μL于10 mL離心管中，加蒸餾水至4 mL，混勻后先后加入80 μL 2%的4-氨基安替比林溶液和80 μL 8%的鐵氰化鉀溶液，混勻后測(cè)定其在500 nm處的吸光值.根據(jù)苯酚質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線獲知樣品中剩余苯酚的量，計(jì)算菌體對(duì)苯酚的利用率.當(dāng)菌體濃度開始下降，即培養(yǎng)基中的苯酚利用殆盡時(shí)，終止取樣.

2 結(jié)果與分析

2.1 文庫(kù)的構(gòu)建與鑒定

由于菌株CH34基因組的GC含量較高，NotⅠ酶切后產(chǎn)生的條帶較多，不便于文庫(kù)插入片段大小的鑒定.通過對(duì)CH34基因組的分析，為了更方便準(zhǔn)確地確定文庫(kù)插入片段的大小，選用XbaⅠ進(jìn)行酶切，并對(duì)該文庫(kù)插入片段的大小進(jìn)行了鑒定，結(jié)果如圖1所示，其中1～25為樣品編號(hào)，M為1 kb Marker.鑒定時(shí)，隨機(jī)挑取96個(gè)克隆.酶切結(jié)果表明，98%的克隆含有插入片段，插入大小分布在20～120 kb之間，平均大小約為30 kb，其中約有61%的克隆插入片段大于50 kb.根據(jù)平均插入片段(約30 kb)和文庫(kù)的總?cè)萘?約3萬克隆)計(jì)算，此文庫(kù)覆蓋了約9 000 Mb的基因組序列.根據(jù)CH34基因組7.25 Mb大小估算，此文庫(kù)約覆蓋了CH34基因組的1 240倍.

圖1 C.metallidurans CH34的25個(gè)BAC文庫(kù)克隆XbaⅠ酶酶切圖譜Fig.1 XbaⅠrestriction map of the 25 clones from the BAC library of C.metallidurans CH34

2.2 文庫(kù)的篩選

從文庫(kù)中隨機(jī)挑選3 000個(gè)克隆，并最終得到了5個(gè)長(zhǎng)簇的陽性克隆(見圖2，其中1為負(fù)對(duì)照，2～6為樣品編號(hào)，7為正對(duì)照，M為100 bp Marker)和4個(gè)短簇陽性克隆(見圖3，其中1～4為樣品編號(hào)，5為正對(duì)照，6為負(fù)對(duì)照，M為100 bp Marker).對(duì)得到的9個(gè)陽性克隆攜帶的苯酚羥化酶基因進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)與NCBI中已收錄的C.metallidurans CH34的苯酚羥化酶基因序列完全一致，這說明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的BAC文庫(kù)中的克隆，其插入的基因組序列不會(huì)發(fā)生突變，具有很好的穩(wěn)定性.

圖2 根據(jù)長(zhǎng)簇的LmPH基因設(shè)計(jì)引物，篩選到的5個(gè)陽性克隆的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification ofthe 5 positive clones according to the LmPH gene on the longer cluster

圖3 根據(jù)短簇的LmPH基因設(shè)計(jì)引物，篩選到的4個(gè)陽性克隆的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of the 4 positive clones according to the LmPH gene on the shorter cluster

2.3 陽性克隆的選取

9個(gè)陽性克隆BAC質(zhì)粒DNA經(jīng)ScaⅠ酶切后的電泳結(jié)果如圖4所示，其中1～5為含有長(zhǎng)簇的陽性克隆，6～9為含有短簇的陽性克隆，M為1 kb Marker.CH34長(zhǎng)短2個(gè)苯酚降解基因簇的酶切位點(diǎn)圖譜如圖5所示.結(jié)果顯示，長(zhǎng)簇的4號(hào)克隆和短簇的2號(hào)克隆為擁有完整降酚基因簇的克隆.

圖4 9個(gè)陽性克隆經(jīng)ScaⅠ酶切后的電泳圖Fig.4 Electrophoresis of the 9 positive clones digested with ScaⅠ

圖5 C.metallidurans CH34長(zhǎng)短2個(gè)苯酚降解基因簇的酶切位點(diǎn)圖譜Fig.5 Restriction map of the 2 phenol-degradating gene clusters from C.metallidurans CH34

2.4 陽性克隆的功能分析

表1為長(zhǎng)簇的4號(hào)克隆和短簇的2號(hào)克隆所轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在不同苯酚質(zhì)量濃度下的生長(zhǎng)情況，表2和表3為這2個(gè)克隆對(duì)苯酚的利用效率.可以看出，2個(gè)轉(zhuǎn)化子在苯酚質(zhì)量濃度較低時(shí)生長(zhǎng)較好，但當(dāng)苯酚質(zhì)量濃度達(dá)到800 mg/L時(shí)，幾乎不生長(zhǎng);在相同苯酚質(zhì)量濃度下，含有短簇的轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)狀況以及苯酚利用情況都優(yōu)于含有長(zhǎng)簇的轉(zhuǎn)化子;2個(gè)轉(zhuǎn)化子在苯酚質(zhì)量濃度較低時(shí)，對(duì)苯酚的利用率均較高.研究還發(fā)現(xiàn)，作為負(fù)對(duì)照的含有空載BAC質(zhì)粒的大腸桿菌，在苯酚質(zhì)量濃度較低時(shí)也表現(xiàn)出了一定的苯酚利用率，推測(cè)可能大腸桿菌本身就具有一定的苯酚耐受性.

3 結(jié)束語

本研究構(gòu)建的BAC文庫(kù)覆蓋了C.metallidurans CH34基因組約1 240倍，具有很好的覆蓋率，適合用于基因簇大片段的克隆和鑒定，為深入研究多套降酚基因簇在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)(例如，存在拮抗還是促進(jìn)作用)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

從結(jié)果上看，含有長(zhǎng)簇和短簇的轉(zhuǎn)化子在含有較低質(zhì)量濃度的苯酚培養(yǎng)基中，降酚能力均較好，但隨著苯酚質(zhì)量濃度的升高，其生長(zhǎng)能力及降酚效率都出現(xiàn)了降低，表明CH34苯酚降解基因簇在大腸桿菌中表現(xiàn)為低質(zhì)量濃度苯酚耐受性.在相同苯酚質(zhì)量濃度下，短簇轉(zhuǎn)化子的降酚能力強(qiáng)于長(zhǎng)簇，可能是由于長(zhǎng)簇上存在多個(gè)編碼反式抑制因子的基因，阻礙了苯酚降解基因的轉(zhuǎn)錄.此外，從這2個(gè)簇的序列和基因排布上看，它們存在很大的差異，且長(zhǎng)簇的一側(cè)重復(fù)出現(xiàn)了部分降解基因PLMN等.因此，本研究通過構(gòu)建BAC文庫(kù)，克隆到2個(gè)完整的苯酚降解基因簇，并研究其在大腸桿菌中對(duì)苯酚的利用效率，從而能夠較直觀地反映兩簇的整體降酚能力.今后的研究將深入探討2個(gè)簇之間的互作關(guān)系，通過選擇合適的載體，把2個(gè)苯酚降解基因簇連到同一載體上，比較所得轉(zhuǎn)化子與只含有一個(gè)簇的轉(zhuǎn)化子在降酚能力方面的差異，從而確定這2個(gè)簇之間是否存在促進(jìn)或拮抗的相互作用.

表1 2個(gè)陽性克隆在不同苯酚質(zhì)量濃度下的生長(zhǎng)情況(OD600)Table 1 Growth of the 2 positive clones in different phenol concentrations(OD600)

表2 2個(gè)陽性克隆在不同苯酚質(zhì)量濃度下對(duì)苯酚的利用情況(OD500)Table 2 Phenol utilization of the 2 positive clones in different phenol concentrations(OD500)

表3 2個(gè)陽性克隆在不同苯酚質(zhì)量濃度下對(duì)苯酚的降解效率Table 3 Degradation efficiency of the 2 positive clones in different phenol concentrations %

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