胡鵬飛， 賴東武， 何 紅

(浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院心內(nèi)科，浙江杭州310016)

晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是非酶糖化反應的終末期產(chǎn)物，正常人隨著年齡的增加，AGEs會緩慢增加，但糖尿病病人由于長期高血糖狀態(tài)，導致體內(nèi)糖化反應及AGEs生成加速。已有多項研究表明AGEs是引起糖尿病血管并發(fā)癥的重要誘因之一［1］。AGEs能夠在糖尿病病人血管壁沉積，促進內(nèi)皮細胞凋亡并增加其促凝活性，從而啟動并加速動脈粥樣硬化的形成［2］。自噬是一種溶酶體依賴的細胞內(nèi)受損細胞器或代謝產(chǎn)物的降解過程，其作為細胞的防御保護機制，與細胞凋亡之間有密不可分的聯(lián)系［3］。多項研究表明AGEs能誘導內(nèi)皮細胞凋亡［4］，但關于AGEs與自噬之間可能存在的病理生理聯(lián)系，目前尚不清楚。調(diào)節(jié)自噬的相關信號通路較多，其中，PI3K/Akt/mTOR信號通路是一條重要的自噬相關信號通路。本研究以自噬相關蛋白LC3－II的表達作為衡量自噬水平的主要指標，初步研究AGEs誘導內(nèi)皮細胞自噬的相關機制及其在AGEs誘導內(nèi)皮細胞凋亡中的作用。為臨床上保護血管內(nèi)皮細胞，防治糖尿病合并動脈粥樣硬化開辟新的途徑。

材料和方法

1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自上海中科院細胞研究所;抗LC3－Ⅱ多克隆抗體購自Novus;蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)多克隆抗體、磷酸化蛋白激酶B(phospho－protein kinase B，p－Akt)多克隆抗體、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)多克隆抗體和磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phospho－mammalian target of rapamycin，p－mTOR)多克隆抗體均購自Cell Signaling;DMEM培養(yǎng)基購自Gibco;胎牛血清購自四季青公司;內(nèi)毒素凋亡試劑盒購自上海潤成公司;3－甲基腺嘌呤(3－methyladenine，3 － MA)、MTT、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和D－葡萄糖均購于 Sigma;胰島素樣生長因子1(insulin－like growth factor 1，IGF－1)購自 R＆D;Alexa Fluor 488 Annexin V/PI細胞凋亡試劑盒購自Invitrogen。

2 方法

2.1 HUVECs的培養(yǎng) HUVECs用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。用0.25%胰酶(含EDTA)消化傳代。細胞在培養(yǎng)24 h后加入AGEs等處理因素。

2.2 AGEs的制備 參照文獻［5］，0.5 g BSA 和 3.0 g D－葡萄糖溶于10 mL 0.5 mol/L PBS(pH 7.4)中，濾膜除菌后恒溫37℃避光孵育16周。相同條件下，以不含D－葡萄糖的PBS孵育BSA作為對照組，AGEs和BSA內(nèi)毒素含量由內(nèi)毒素檢測試劑盒測定并確保 ＜ 2.5 kU/L。

2.3 透射電鏡 電鏡檢測AGEs處理HUVECs后細胞內(nèi)自噬體的變化。將 HUVECs以 4.0×105cells/well的密度接種于6 cm細胞培養(yǎng)皿中，24 h后加入AGEs(終濃度100 mg/L)處理6 h，消化收集細胞，用3%戊二醛固定，Hitachi H－7650 TEM電鏡分析。

2.4 Alexa Fluor 488 Annexin V/PI雙標記法檢測細胞凋亡 流式細胞術檢測AGEs誘導HUVECs的凋亡情況。將HUVECs以2.0×105cells/well的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后處理并收集細胞。1×Annexin－binding buffer重懸，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×109/L，加入 5 μL Alexa Fluor 488 和 5 μL(100 mg/L)PI工作液，室溫孵育15 min后，加入400 μL 1×Annexin－binding buffer輕混后用FACS Calibur流式細胞儀檢測，結果用BD CellQuest軟件分析。

2.5 MTT比色法測定細胞活性 取對數(shù)生長期內(nèi)皮細胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后分別加入AGEs或 BSA(100 mg/L)，3－MA(2 mmol/L)，每組設5個復孔，每孔終體積為200 μL。培養(yǎng)48 h后每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37℃孵育4 h后吸去上清，每孔加入100 μL DMSO，振蕩搖勻。用酶標儀于570 nm波長條件下測定吸光度值。

2.6 Western blotting 檢測 LC3、p － Akt、Akt、p －mTOR和mTOR的表達 收集HUVECs后，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解30 min，13 000×g離心10 min，取上清，BCA法進行蛋白定量。與5×樣品緩沖液混合后，煮沸5 min。將樣品(50 μg)進行SDS－PAGE，然后轉印至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h，相應的Ⅰ抗4℃孵化過夜。TBS－T洗3次后加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，ECL法顯色，圖像結果采用 LAS－4000－Mini化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行分析。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 AGEs誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞自噬

1.1 100 mg/L AGEs或 BSA 處理 HUVECs 6 h，與對照組及BSA組相比，AGEs組的自噬相關蛋白LC3－II的表達量明顯增加(P＜0.05)，見圖1A。不同時點(0、2、6、24 h)100 mg/L AGEs處理 HUVECs，與對照組比較，隨著時間變化，自噬相關蛋白LC3－II的表達量先升高后下降，峰值出現(xiàn)在6 h(P＜0.05)，見圖 1B。不同濃度(0、50、100、200 mg/L)AGEs處理HUVECs 6 h，隨著AGEs濃度的增加，自噬相關蛋白LC3－II的表達量明顯增加(P＜0.05)，見圖1C。以上結果表明在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中AGEs能顯著增高內(nèi)皮細胞的自噬水平，并具有一定的濃度和時間依賴性。

1.2 透射電鏡檢測自噬 100 mg/L AGEs或BSA處理HUVECs 6 h后，未處理組和BSA組均未見到明顯的自噬體，但AGEs組可看到胞質中出現(xiàn)較多的獨立雙層及多層膜結構的自噬體，見圖1D。

Figure 1.AGEs induced autophagy in HUVECs.A，B and C:Western blotting analysis of LC3－II protein levels treated with BSA or AGEs.A:cells were treated with 100 mg/L AGEs or BSA for 6 h;B:cells were treated with 100 mg/L AGEs for 0，2，6，12 and 24 h;C:cells were treated for 6 h with 0，50，100，200 mg/L AGEs.Compared with control and BSA groups，the expression of LC3－II protein was notably increased in a time－and dose－dependent manner in AGE－treated cells±s.n=4.*P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs 0 h;#P ＜0.05 vs 0 mg/L.D:representative electron micrographs of HUVECs treated with 100 mg/L BSA or AGEs for 6 h.Typical autophagic vacuoles containing cellular material or membranous structures(bold arrows)were frequently found in cells treated with AGEs but not BSA.圖1 AGEs誘導HUVECs自噬相關蛋白LC3－II的表達

Figure 2.Effect of autophagy on viability of HUVECs treated with AGEs.Compared with control group，HUVECs treated with AGEs(100 mg/L，48 h)showed decreased viability.This effect could be further decreased by pretreating cells with the autophagy inhibitor 3－MA.±s.n=4.*P＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs AGEs.圖2 自噬對AGEs誘導的內(nèi)皮細胞活性的影響

2 自噬在AGEs誘導的內(nèi)皮細胞凋亡中的作用

2.1 MTT比色法測定細胞活性 用 100 mg/L AGEs處理HUVECs 48 h，其中1組用自噬抑制劑3－MA(2 mmol/L)提前0.5 h預處理，單用3－MA組與對照組比較細胞活性沒有差異。AGEs組與對照組相比細胞活性明顯下降(P＜0.05)。預先用3－MA處理后的AGEs組細胞活性較單用AGEs組進一步下降(P＜0.05)，見圖2，說明抑制自噬加劇了AGEs誘導的內(nèi)皮細胞活性下降。

2.2 Annexin V－FITC/PI雙染標記法檢測細胞凋亡 用100 mg/L AGEs處理HUVECs 48 h，其中1組用自噬抑制劑3－MA(2mmol/L)提前0.5h預處理，單用3－MA組與對照組比較細胞凋亡率沒有差異，AGEs組與對照組比較細胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)，預先用3－MA處理后的AGEs組細胞凋亡率較AGEs組進一步下降(P＜0.05)，見圖3。抑制自噬加劇了AGEs誘導內(nèi)皮細胞凋亡。以上2項實驗結果表明自噬在AGEs誘導的內(nèi)皮細胞凋亡中起保護作用。

Figure 3.Effect of autophagy on apoptosis of HUVECs treated with AGEs.Compared with control group，HUVECs treated with AGEs(100 mg/L，48 h)showed increased apoptosis.This effect could be further increased by pretreating cells with the autophagy inhibitor 3－MA.±s.n=4.*P＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs AGEs.圖3 自噬對AGEs誘導的內(nèi)皮細胞凋亡的影響

3 PI3K/Akt/mTOR信號通路在AGEs誘導HUVECs自噬過程中的作用

AGEs刺激之后，p－Akt和p－mTOR的表達水平隨著作用時間的延長而下降，并在15或30 min時達最低值(P＜0.05)，見圖4A。這表明在HUVECs中，AGEs可以抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路。200 μg/L IGF－1能夠明顯激活Akt的磷酸化水平(P＜0.05)，見圖4B。與AGEs處理組相比較，IGF－1提前2 h預處理組能顯著抑制AGEs誘導的內(nèi)皮細胞自噬相關蛋白LC3－II的表達(P＜0.05)，見圖4C，這表明PI3K/Akt/mTOR信號通路在AGEs誘導HUVECs自噬的過程中起著重要作用。

討 論

AGEs是蛋白質的氨基與糖的醛基發(fā)生非酶性糖化氧化反應生成不可逆的終末期產(chǎn)物，糖尿病患者體內(nèi)AGEs水平較正常人明顯升高，AGEs在體內(nèi)的累積與糖尿病血管并發(fā)癥密切相關。有研究表明AGEs通過與其特異性受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)結合，激活核轉錄因子(nuclear factor－kappa B，NF－κB)，促進腫瘤壞死因子((tumor necrosis factor－α，TNF－α)分泌增加，誘導內(nèi)皮細胞凋亡［4］。內(nèi)皮細胞凋亡不僅會減弱血管內(nèi)皮預防血脂沉積的屏障作用、局部抗凝和纖溶機制，而且凋亡的內(nèi)皮細胞會產(chǎn)生促凝作用，這些因素會啟動并加速動脈粥樣硬化的發(fā)展［6］。自噬是廣泛存在于真核細胞中的生命現(xiàn)象，即細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質，清除受損細胞器、代謝產(chǎn)物，以維持細胞的穩(wěn)定狀態(tài)。自噬作為一種生理或病理現(xiàn)象存在于動脈粥樣硬化、心衰等多種心血管疾病當中［7－8］。但自噬是否參與了AGEs誘導的多種病理生理過程，目前尚不清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn)AGEs能夠誘導內(nèi)皮細胞自噬水平增加，自噬在AGEs誘導內(nèi)皮細胞凋亡中起保護作用，同時我們進一步闡明了AGEs誘導自噬的機制。

低水平的自噬廣泛存在于細胞的正常生理過程中。但在缺氧、炎癥、氧化應激等不良環(huán)境中，細胞可通過增強自噬來清除細胞內(nèi)受損細胞器及代謝產(chǎn)物，對細胞起保護作用，但過度自噬也會損傷細胞，觸發(fā)自噬性細胞死亡機制，促進細胞死亡［9－10］。在疾病的不同發(fā)展階段，自噬的作用也不盡相同。Matsui等［11］發(fā)現(xiàn)在心肌缺血階段，自噬對心肌細胞起保護作用，而在再灌注階段進一步增強的自噬則對心肌細胞有損傷作用。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)AGEs能夠降低內(nèi)皮細胞活性，增加內(nèi)皮細胞凋亡率。但使用自噬抑制劑3－MA特異性抑制自噬后細胞活性進一步下降，細胞的凋亡率也進一步增加。我們推測在AGEs作用于內(nèi)皮細胞時，自噬作為一種防御機制被誘導發(fā)生，用于清除AGEs引起的一些損傷細胞器和代謝產(chǎn)物，延緩凋亡的發(fā)生，從而發(fā)揮保護作用。這說明AGEs既能誘導內(nèi)皮細胞凋亡，也能誘導其發(fā)生自噬，自噬在AGEs誘導的內(nèi)皮細胞凋亡中起保護作用，它部分對抗了AGEs引起的內(nèi)皮細胞凋亡。

Figure 4.Role of the PI3K/Akt/mTOR signal pathway in AGE－induced HUVECs autophagy.A and B:Western blotting analysis of the Akt/mTOR pathway in HUVECs treated with AGEs.In HUVECs，phosphorylation of Akt and mTOR decreased 30 min and 1 h after treatment with 100 mg/L AGEs.C:insulin－like growth factor 1(IGF－1)was used to activate the Akt pathway.Cells pretreated with IGF －1(200 μg/L)for 2 h showed a notable increase in Akt phosphorylation.D:Western blotting analysis of LC3－II expression in AGE(100 mg/L，6 h)－ and IGF－1－treated cells.Pretreatment with IGF－1(200 μg/L)suppressed the AGE－induced expression of LC3－II in HUVECs.±s.n=4.*P＜0.05 vs control;△P＜0.05 vs AGEs.圖4 PI3K/Akt/mTOR信號通路在AGEs誘導HUVECs自噬過程中的作用

PI3K/Akt/mTOR通路是調(diào)節(jié)自噬的一條重要的信號通路，當Akt被激活后可磷酸化馬鈴薯球蛋白(tuberous sclerosis complex 2，TSC2)，后者可增強mTOR活性，從而抑制自噬，故該通路對自噬起負性調(diào)節(jié)作用［12－13］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，AGEs刺激能使內(nèi)皮細胞Akt和mTOR的磷酸化水平都顯著下降，但使用Akt激活劑IGF－1使Akt的磷酸化水平恢復后，AGEs誘導內(nèi)皮細胞自噬相關蛋白LC3－II的表達量即明顯下降，這說明在HUVECs上，AGEs是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導內(nèi)皮細胞自噬水平的升高。mTOR作為調(diào)節(jié)自噬的關鍵靶點，也是臨床上多重種藥物的作用靶點。該機制的闡明為進一步在動物實驗或臨床上干預AGEs誘導內(nèi)皮細胞自噬提供了理論依據(jù)。

綜上所述，通過實驗我們證明了AGEs能夠誘導HUVECs自噬活性增強，自噬在AGEs誘導內(nèi)皮細胞凋亡中起保護作用，能夠對抗內(nèi)皮細胞的凋亡。Akt的激動劑IGF－1能夠抑制該作用，說明PI3K/Akt/mTOR信號通路在AGEs誘導內(nèi)皮細胞自噬的過程中發(fā)揮重要作用。因此，對細胞的自噬水平進行干預可能是治療糖尿病心血管并發(fā)癥新的突破口，但還需要具體的動物學實驗進一步深入研究。

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