樊永正，陳倩倩，劉伯石，趙軍濤，田 巍，周有駿，呂加國，朱 駒(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，上海200433)

精子頂體酶是位于精子頂體內(nèi)層漿膜上的膜結(jié)合性酶，是一種類似于胰蛋白酶樣的絲氨酸蛋白水解酶，以酶原形式儲存在頂體內(nèi)。發(fā)生頂體反應(yīng)時(shí)，頂體酶原自動(dòng)激活成β-頂體酶(β-acrosin)。β-頂體酶是一種多功能的蛋白質(zhì)，它可以分散頂體基質(zhì)，也能作為次級配位分子維持精子結(jié)合在卵子透明帶(ZP)上進(jìn)行頂體反應(yīng)［3］。頂體酶釋放后能將卵細(xì)胞的透明帶水解出一條通道，便于精子穿過透明帶與卵細(xì)胞融合。抑制頂體酶的活性便可以阻止受精，從而避孕［1～4］。因此人精子頂體酶是公認(rèn)的避孕藥物新作用靶點(diǎn)之一［5］。呂加國等［6，7］構(gòu)建了人精子頂體酶活性位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)，并分析了活性位點(diǎn)重要氨基酸殘基性質(zhì)。人精子頂體酶活性位點(diǎn)大體分為三個(gè)區(qū)域:P1，P2，G。P1區(qū)口袋深但開口小，是配體結(jié)合最重要的極性區(qū)域;P2區(qū)口袋淺但開口較大;G槽是腔右側(cè)一個(gè)狹長的淺凹槽。P1含有T216、C217、Q218、S221、W243等關(guān)鍵殘基;P2中有R252、R199、Y196、G198等關(guān)鍵殘基;而G槽分布有E120、H69、W243關(guān)鍵殘基。上述關(guān)鍵殘基在頂體酶的活性中發(fā)揮重要作用，基于上述關(guān)鍵殘基的分布、活性腔極性與立體結(jié)構(gòu)大小及計(jì)算機(jī)輔助模擬發(fā)現(xiàn)，苯并咪唑類母核可通過氫鍵或疏水作用與頂體酶結(jié)合，從而可能起到抑酶活性，本研究設(shè)計(jì)了苯并咪唑類化合物，并考察不同取代基的化合物對人精子頂體酶活性的影響。

筆者在苯并咪唑母核的2位和5位上分別引入長鏈和短鏈的取代基團(tuán)，同時(shí)根據(jù)P1腔關(guān)鍵殘基的分布，探討2位取代基中不同取代長度的取代基與P1腔中重要?dú)埢慕Y(jié)合情況，以及5位取代的不同長度的取代基與P2或G的相互作用情況?；诖朔N想法，在苯并咪唑的5位分別引入硝基和磺酰胺基，在其2位引入不同長度的醇酰胺的基團(tuán)，設(shè)計(jì)并合成了10個(gè)苯并咪唑類新型人精子頂體酶抑制劑化合物，并進(jìn)行活性測試。合成路線詳見圖1。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)采用的人精子頂體酶三維分子模型及活性腔性質(zhì)取自筆者前期研究［8］，分子模 擬 采 用 InsightII和 SYBYL 軟 件 包，AutoDock3.05完成;所有計(jì)算機(jī)工作都在SGI服務(wù)器(Origin300)上完成。所有參數(shù)除特別指明外均為默認(rèn)值。

1.2 化合物設(shè)計(jì) 在Sybyl6.9中構(gòu)建抑制劑分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)行分子力學(xué)優(yōu)化和模擬退火計(jì)算，選取代表性低，能構(gòu)象用于進(jìn)一步的分子對接研究。分子對接采用AutoDock3.05。對接過程采用Lamarckian遺傳算法，將局部能量搜索與遺傳算法相結(jié)合，以半經(jīng)驗(yàn)勢函數(shù)作為能量打分函數(shù)，對小分子構(gòu)象和位置進(jìn)行全局搜索。每個(gè)分子根據(jù)柔性鍵的多少進(jìn)行30～50次獨(dú)立的對接計(jì)算，對結(jié)果進(jìn)行成簇分析，最后依據(jù)結(jié)合自由能和成簇分析的情況來選取合理的結(jié)合模式。

1.3 化學(xué)合成

1.3.1 儀器及試劑 熔點(diǎn)采用上海精密科學(xué)儀器有限公司(SGW)X-2熔點(diǎn)儀測定;核磁共振氫譜采用Bruker AC-300P型儀器測定(溶劑為DMSO，300 MHz)。MS(ESI)采用DECA XPMAXLCQ型質(zhì)譜儀;其它試劑均為市售分析純。硅膠薄層板采用煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司產(chǎn)品(HSGF254)。

1.3.2 中間體2(1H-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯)的制備 于圓底燒瓶中加入含氯化鈣11.1 g(0.1 mol)的水溶液70 ml，再緩慢加入2-氨基苯并咪唑13.2 g(0.1 mol)，攪拌加熱使之溶解，隨后加入四丁基溴化銨0.1 g(0.3 mmol)，再加入碳酸二甲酯25 ml(0.3 mol)。于90～100℃加熱回流反應(yīng)7 h，反應(yīng)完畢后趁熱過濾，濾液靜置結(jié)晶，析出粗品白色固體，過濾，己烷重結(jié)晶得中間體2，文獻(xiàn)值:mp.305.7～306.5℃［9］。

1.3.3 目標(biāo)化合物3(1H-苯并咪唑-2-脲類)的制備

于圓底燒瓶中加入1 g中間體2(5.2 mmol)，加入20 ml的吡啶溶液，然后再加入5 ml的各種醇胺溶液，于油浴85℃下回流5～7 h后，TLC檢測反應(yīng)完全后，旋干有機(jī)溶劑，加入20 ml水，常溫?cái)嚢柘?，析出粗品白色固體，用甲醇重結(jié)晶得到目標(biāo)化合物3。

1.3.4 中間體4(5-硝基-1H-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯)的制備 在干燥的250 ml三頸燒瓶中加入3.8 g中間體2(0.019 9 mol)，量取4 ml的濃硫酸緩慢加入，放置于預(yù)設(shè)定的－3℃的低溫恒溫反應(yīng)浴中，靜置20 min后，量取4 ml的發(fā)煙硝酸緩慢滴入溶液中，邊滴邊攪拌，滴加完畢后，迅速升溫至5℃，反應(yīng)3 h后，TLC檢測反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液倒入冰水中，析出粗品黃色固體，抽濾烘干后，用甲醇重結(jié)晶后得目標(biāo)化合物4(3.08 g，產(chǎn)率81%)。

1.3.5 目標(biāo)化合物5(5-硝基-1H-苯并咪唑-2-脲類)的制備 于圓底燒瓶中加入1 g中間體4(5.2 mmol)，加入20 ml的吡啶溶液，然后再加入5 ml的各種醇胺溶液，于油浴85℃下回流5～7 h后，TLC檢測反應(yīng)完全后，旋干有機(jī)溶劑，加入20 ml水，常溫?cái)嚢柘拢龀龃制钒咨腆w，用甲醇重結(jié)晶得到目標(biāo)化合物5。

1.3.6 中間體6(5-氯磺酸基-1H-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯)的制備 在干燥的250 ml三頸燒瓶中加入氯磺酸50 ml，冰浴控制反應(yīng)溫度保持20℃以下緩慢加入19.1 g(0.1 mol)中間體2，加畢待固體全溶后將油浴鍋升溫至40～45℃反應(yīng)3 h，TLC檢測反應(yīng)，待反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液于機(jī)械攪拌下緩慢滴入約750 g碎冰中，析出粉紅色固體。懸濁液用干燥的乙酸乙酯分次萃取，分出乙酸乙酯層，旋干得粉紅色固體6。

1.3.7 中間體7(5-磺酰芐胺-1H-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯)的制備 于100 ml圓底燒瓶中加入0.5 g(1.73 mmol)中間體6，取干燥的四氫呋喃(THF) 40 ml溶解后加入三乙胺(TEA)1 ml(7.19 mmol)，加入芐胺(2.08 mmol)，常溫反應(yīng)過夜。點(diǎn)板檢測反應(yīng)完全后過濾得類白色固體，將固體以2%的鹽酸溶液洗滌，再以5%碳酸氫鈉溶液洗滌，最后清水洗滌得粗品白色固體產(chǎn)物7，用甲醇重結(jié)晶得到目標(biāo)化合物7。

1.3.8 目標(biāo)化合物8［5-(N-芐基氨磺酰基取代)-1H-苯并咪唑-2-脲類］的制備 于圓底燒瓶中加入1 g中間體7(5.2 mmol)和20 ml的吡啶溶解完全，然后再加入5 ml的各種醇胺溶液，于油浴85℃下回流5～7 h后，TLC檢測反應(yīng)完全后，旋干有機(jī)溶劑，加入20 ml水，常溫?cái)嚢柘?，析出粗品白色固體析出，用甲醇重結(jié)晶得到目標(biāo)化合物8。目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)表征詳見表1和表2。

表1 目標(biāo)化合物的氫譜數(shù)據(jù)

1.4 抗生育活性實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)以Nα-苯甲酰-DL-精氨酸-ρ-硝酰基苯胺(BAPNA)為底物，與精子釋放的頂體酶反應(yīng)，采用改良Kennedy法測定所合成的化合物對人精子頂體酶的抑制能力。試劑盒購自江蘇省南京欣迪生物藥業(yè)工程有限公司，試劑盒包括:分離劑、頂體酶激活劑、抑制劑、反應(yīng)底物劑。方法參見文獻(xiàn)［10］。抑酶活性結(jié)果見表3。

表2 目標(biāo)化合物的其它理化數(shù)據(jù)

表3 目標(biāo)化合物的抑酶活性(IC50mmol/L)

2 結(jié)果與討論

2.1 筆者采用分子對接方法研究了化合物8a與人頂體酶之間的相互作用模式見圖2。結(jié)果顯示:化合物8a的母核在G槽內(nèi)，其2位和5位側(cè)鏈分別延伸到P1腔和P2腔，在P1腔內(nèi)，絲氨酸(Ser242)作為氫鍵受體，蘇氨酸(Thr216)作為氫鍵供體分別與2位側(cè)鏈的酰胺氫和羥基氧形成氫鍵作用，同時(shí)2位側(cè)鏈與P1腔的Ser221、Trp243等重要?dú)埢休^強(qiáng)疏水作用。母核與 G槽中的 His69、Glu120、Arg199等重要?dú)埢休^強(qiáng)疏水的作用，5位側(cè)鏈末端苯環(huán)伸入P2腔與Gly244、Val245、Arg252等重要?dú)埢休^強(qiáng)疏水作用。故化合物8a的體外抑酶活性遠(yuǎn)高于陽性對照品TLCK。

2.2 筆者考察了上述苯并咪唑類先導(dǎo)化合物的體外抑酶作用。結(jié)果顯示所有測試化合物均具有抑酶活性;尤其是化合物8a，活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陽性對照品TLCK?；衔锱c靶酶作用模式及抑酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物3a-5d由于5位取代基較短，其活性遠(yuǎn)不及化合物8a，這提示了化合物5位側(cè)鏈的長短對抑酶活性有較大的影響:5位側(cè)鏈短，在P2腔內(nèi)的疏水作用較小，則抑酶活性相對較弱;5位側(cè)鏈長，則與活性腔氨基酸殘基有較強(qiáng)的疏水作用，即結(jié)合力增強(qiáng)，活性也大大增強(qiáng)。化合物8a的2位側(cè)鏈與靶酶通過氫鍵、疏水等作用相互結(jié)合，提示在2位側(cè)鏈引入能夠形成氫鍵的基團(tuán)，如羥基、氨基等及脂肪鏈等疏水基團(tuán)也能夠提高分子與靶酶的親和力，從而有利于提高抑酶活性。在本研究中，基于人精子頂體酶三維結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了苯并咪唑類化合物，該類化合物主要與靶酶活性腔氨基酸殘基以氫鍵、疏水作用相結(jié)合從而產(chǎn)生抑酶活性。進(jìn)一步對該類化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，有利于發(fā)現(xiàn)高效、低毒的新型人精子頂體酶活性抑制劑。本研究為男性抗生育研究提供了新的結(jié)構(gòu)類型。

圖2 化合物8a與頂體酶對接

［1］ Sipila P，Jalkanen J，Huhtaniemi IT，et al.Novel epididyml proteins as targets for the development of post-testicular male contraception［J］.Reproduction，2009，137:379.

［2］ Moreno RD，Alvarado CP.The Mammalian acrosome as a secretory lysosome:new and old evidence［J］.Mol Repord Dev，2006，73(11):1430.

［3］ Rawe VY，Diaz ES，Chemes HE，et al.The role of sperm proteasomes during sperm aster formation and early zygote development:implications for fertilization failure in humans［J］.Mol Human Repord，2008，23(3):573.

［4］ Mishra PK，Manivannan B，Pathak N，et al.Status of spermatogenesis and sperm parameters in langur monkeys following longterm vas occlusion with styrene maleic anhydride［J］.Androl，2004，24(4):501.

［5］ Jones R，Parry R，Leggio L，et al.Inhibition of sperm-zona binding by suramin，a potential‘lead’compound for design of new anti-fertility agents［J］.Mol.Human Reprod，1996，2:597.

［6］ 呂加國，盛春泉，張 珉，等.人頂體酶三維結(jié)構(gòu)的同源模建及其與KF950的分子對接研究［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2006，64 (10):1073.

［7］ 寧微微，呂加國，劉雪飛，等.新型喹唑啉酮類先導(dǎo)物的設(shè)計(jì)、合成及抑制人頂體酶活性研究［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2010，28 (4):296.

［8］ 張 玨，呂加國，朱 駒，等.人頂體酶活性腔性質(zhì)及與抑制劑的結(jié)合模式［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2009，30(12):2409.

［9］ Ono Y.Dimethy1 carbonate for Emironmentally benign reaction.Pure＆Appl Chem.1996，68(2):367.

［10］ 宋桂紅，張 玨，張曉夢，等.南德士抑制人精于頂體酶活性的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華男科學(xué)雜志，2009，15(8):700.