吳 昊，宋洪濤(1.福建醫(yī)科大學(xué)福總臨床醫(yī)學(xué)院，福建 福州 35005;.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科，福建 福州35005)

西羅莫司(sirolimus，SRL)是大環(huán)內(nèi)酯類的免疫抑制劑，臨床上用于器官移植抗排斥作用，美國(guó)惠氏公司的西羅莫司納米結(jié)晶片，口服生物利用度僅為17%，由于該藥屬于藥物生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(BCS)Ⅱ類藥物［1］，即溶解度差(37℃溶解度為0.572 6 μg/ml)，膜通透性好，因此限制其口服吸收的主要因素是溶解度。本實(shí)驗(yàn)以固態(tài)和液態(tài)脂質(zhì)為藥物載體制備NLC，它是一種平均粒徑在納米級(jí)別，粒徑分布窄的載藥脂質(zhì)納米粒，口服能提高藥物的溶解度和溶出速率［2］，并且脂質(zhì)載體能增強(qiáng)淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)藥物經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)途徑吸收［3，4］，因此具有改善難溶性藥物口服生物利用度的潛質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用CCD-RSM法篩選最優(yōu)處方，并對(duì)其體外釋放度進(jìn)行初步研究。

1 材料與儀器

1.1 材料 SRL對(duì)照品(純度:99.9%)、SRL原料藥(純度:99.6%，批號(hào):100401)均由福建科瑞藥業(yè)有限公司提供，西羅莫司納米結(jié)晶片(commercial sirolimus tablet，CST，美國(guó)惠氏公司)，44/14(Gelucire 44/14，月桂酸聚乙二醇甘油酯，法國(guó)嘉法賽，批號(hào)122189，)，GTCC(crodamol GTCC，中碳鏈脂肪酸甘油酯，英國(guó)Croda，批號(hào)15013)，Tween-80(聚山梨酯80，湖南爾康制藥有限公司，批號(hào)20100402)，SDS(十二烷基硫酸鈉，湖南爾康制藥有限公司，批號(hào)20101104)，MD34-14型透析袋(分子量:14 000，美國(guó)Union Carbide公司)。甲醇，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 Agilent1200高效液相色譜系統(tǒng)(UV檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司)，高壓勻質(zhì)機(jī)(NS1001L2K，意大利Niro Soavi公司)，分析天平(AL204，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，集熱式磁力攪拌器(HT-8，常州國(guó)華電器有限公司)，納米激光粒度測(cè)定儀(NICOMP 380ZLS，美國(guó)NICOMP公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件［5］Agilent1200高效液相色譜系統(tǒng)(UV檢測(cè)器，美國(guó) Agilent公司)，色譜柱:Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)Agilent公司)，以乙腈-甲醇-水(45∶34∶21)為流動(dòng)相，流速為1 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm;柱溫50℃;進(jìn)樣量為20 μl。理論塔板數(shù)為1 999，最低檢測(cè)限20 ng/ml。

2.1.2 對(duì)照品溶液的配制 取SRL對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的配制 精密稱定供試品置于容量瓶中加適量甲醇超聲處理15 min，放冷至室溫，繼續(xù)加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.4 方法專屬性考察 按照“2.1.2”項(xiàng)和“2.1.3”項(xiàng)配制SRL的對(duì)照品溶液，供試品溶液和空白NLC分散液的供試品溶液，分別進(jìn)液相。結(jié)果表明輔料對(duì)SRL測(cè)定無(wú)干擾，峰形好，保留時(shí)間6.6 min，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.1.5 線性范圍 精密稱取SRL對(duì)照品5.0 mg，置50 ml量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，稀釋至刻度，得濃度為100 μg/ml對(duì)照品溶液，分別移取0.1、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml置10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋成1、4、8、12、16、20 μg/ml的對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液按“2.1.1”項(xiàng)測(cè)定，以濃度X(μg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=52.979X－9.953 3 (r=0.999 9)，說(shuō)明在1～20 μg/ml濃度范圍內(nèi)SRL峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 精密度 配制濃度為5、10和15 μg/ml樣品溶液，均連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算日內(nèi)精密度，以后連續(xù)5 d測(cè)定并計(jì)算日間精密度，結(jié)果見(jiàn)表1，日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于2%，精密度良好。

表1 日內(nèi)日間精密度測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.1.7 加樣回收率 精密移取100 μg/ml對(duì)照品溶液0.5、1、1.5 ml分別到10 ml空白NLC分散液中進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)，測(cè)得平均加樣回收率為(99.5±0.89)%、(100.0±0.80)%、(100.4± 0.46)%。

2.1.8 Zeta電位和平均粒徑及其分布系數(shù)的測(cè)定 將SRL-NCL分散液用蒸餾水稀釋為載體含量約1%的溶液，用納米激光粒度儀測(cè)定Zeta電位，平均粒徑及其分布系數(shù)。

2.1.9 載藥量和包封率 采用Sephadex G50凝膠柱(15 mm×70 mm)測(cè)定NLC分散液的載藥量和包封率，均勻上樣體積V(ml)的NLC分散液，用流速為1.0 ml/min的蒸餾水洗脫，1 min收集一管，并用適量甲醇溶解稀釋，超聲15 min后按照“2.1.1”法測(cè)定峰面積，以峰面積-時(shí)間做洗脫曲線，如圖2。

圖2 峰面積-時(shí)間洗脫曲線

由上圖2可知，收集5～16 min的洗脫液可計(jì)算得體積V(ml)NLC分散液的藥物包載量M包載(g)，測(cè)定分散液的總密度為ρ(g/ml)，故NLC分散液脂質(zhì)含量M脂質(zhì)(g)=0.1ρV(脂質(zhì)總用量:10%)，載藥量DL(%)=10 M包載/ρV。測(cè)定體積V(ml) NLC分散液中SRL總濃度C(μg/ml)，計(jì)算包封率EE(%)=105M包載/CV。

2.2 SRL-NLC分散液的制備 稱取處方量的固態(tài)脂質(zhì)44/14和液態(tài)脂質(zhì)GTCC在75℃水浴條件下加熱至脂質(zhì)完全熔融后，加入SRL原料藥攪拌均勻成澄明油相，再將同溫度Tween-80的水溶液迅速倒入油相，在300 r/min，30 min條件下磁力攪拌制備初乳，經(jīng)高壓勻質(zhì)機(jī)90MPa乳勻5次，最后于4℃下冷藏得SRL-NLC分散液。同法不加藥制得空白NLC分散液。

2.3 處方優(yōu)化

2.3.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素考察試驗(yàn)結(jié)果，已經(jīng)確定處方中固體脂質(zhì):44/14，液體脂質(zhì):GTCC，脂質(zhì)總用量為10%，工藝條件:300 r/min，30 min磁力攪拌，高壓勻質(zhì)機(jī)90 MPa乳勻5次。由于固液脂質(zhì)比例，投藥量和乳化劑用量對(duì)粒徑及其分布系數(shù)，載藥量和包封率的影響顯著，且這三個(gè)因素確定，處方組成就基本確定，因此，以固液脂質(zhì)比(X1)，投藥量(X2)，乳化劑(X3)作為自變量，平均粒徑(Y1)，粒徑分布(Y2)，載藥量(Y3)和包封率(Y4)為因變量，采用三因素五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)進(jìn)行處方優(yōu)化，因素的極大值和極小值已由單因素試驗(yàn)結(jié)果確定，其代碼和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)安排20個(gè)試驗(yàn)，每個(gè)樣品做3次，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 各因素水平代碼及試驗(yàn)操作值

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.3.2 模型擬合 用Design Expert 8.0.5.0軟件對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性和非線性擬合，模型如下:

以方程的回歸系數(shù)r最大且p最小為原則，結(jié)果二次多項(xiàng)式擬合最好，得擬合方程如下:

2.3.3 效應(yīng)面優(yōu)化 采用Design Expert 8.0.5.0軟件繪制以上擬合方程的效應(yīng)面圖和等高線，結(jié)果如圖3至圖7。

圖3 粒徑效應(yīng)面和等高線

圖4 分布系數(shù)效應(yīng)面和等高線

圖5 包封率效應(yīng)面和等高線

圖6 載藥量效應(yīng)面和等高線

圖7 最佳范圍等高線

圖7左下角的白色部分為最佳范圍，經(jīng)軟件篩選最優(yōu)處方:X1=2.10，X2=0.21，X3=7.33，按照上述處方制備SRL-NLC分散液，比較各指標(biāo)的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值，對(duì)模型的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值比較

由表4可知，各參數(shù)預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的誤差均小于10%，說(shuō)明建立的模型具有較好的預(yù)測(cè)能力。

2.4 最優(yōu)處方工藝的驗(yàn)證 按照最優(yōu)處方:X1= 2.10，X2=0.21，X3=7.33制備3批SRL-NLC分散液，比較每批間各指標(biāo)的差異，結(jié)果如下表5。

表5 3批SRL-NLC分散液指標(biāo)考察結(jié)果(，n=3)

表5 3批SRL-NLC分散液指標(biāo)考察結(jié)果(，n=3)

批號(hào) 粒徑(nm) 分布系數(shù) 載藥量(%)包封率(%) Zeta電位(mv) 1 83.52±0.24 0.198±0.241 1.860±0.11 90.8±0.15 -17.3±0.35 2 81.60±0.33 0.213±0.224 1.795±0.24 91.8±0.27 -18.9±0.45 3 82.50±0.36 0.210±0.318 1.831±0.15 91.2±0.19 -17.7±0.31平均值RSD(%) 82.54±0.78 0.207±0.006 1.829±0.03 91.3±0.41 -18.0±0.68 0.94 2.90 1.64 0.45 3.78

由表5可知，按照最優(yōu)處方工藝制備的3批樣品各指標(biāo)均較好，且RSD值均小于5%，說(shuō)明該處方工藝是穩(wěn)定可靠的。

3 體外釋放度考察

精密移取550 μl SRL-NLC(含SRL 1.0 mg)分散液和一片CST分別置于分子量14 000的透析袋中，按照2010年版中國(guó)藥典溶出度測(cè)定XC第三法，參考已上市西羅莫司納米結(jié)晶片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以0.4%SDS溶液250 ml為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度(37±0.5)℃條件下進(jìn)行體外釋放度試驗(yàn)。分別考察0、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h的累積釋藥度，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。

表6 SRL-NLC分散液和CST的累積釋放度數(shù)據(jù)(s，n=3)

表6 SRL-NLC分散液和CST的累積釋放度數(shù)據(jù)(s，n=3)

取點(diǎn)時(shí)間(h) 累積釋放度(%) SRL-NLC分散液CST 22.7±0.05 0.25 0 57.4±0.09 0.5 0 79.6±0.20 0.75 0 80.1±0.23 1 0 90.2±0.15 2 0 92.6±0.22 4 9.3±1.00 98.1±0.34 6 12.9±9.100 99.2±0.51 8 15.6±10.71 99.2±0.25 12 19.8±12.32 99.2±0.16 24 35.4±13.84 99.2±0.27 36 47.8±9.830 99.1±0.17 48 52.6±7.900 99.2±0.22 60 56.8±14.62 99.2±0.14 72 57.2±13.72 98.9±0.13 84 58.1±18.91 98.8±0.10 96 59.3±17.21 98.9±0.14 108 60.1±14.94 98.7±0.15 120 60.1±18.43 98.6±0.12 0 0

以累積釋放度-時(shí)間作累積釋放曲線，見(jiàn)圖8。

圖8 累積釋放曲線圖—●—CST;—▲—SRL-NLC分散液

4 討論

4.1 本考察以固液脂質(zhì)比、投藥量、乳化劑作為自變量，平均粒徑，粒徑分布，載藥量和包封率為因變量，采用三因素五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)，配以效應(yīng)面法篩選SRL-NLC分散液最優(yōu)處方，結(jié)果最優(yōu)處方:固液脂質(zhì)比為 2.10，投藥量為0.21%，表面活性劑用量為7.33%，且擬合方程均符合多次二項(xiàng)式，P值均小于0.05，擬合性良好，且預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的誤差均小于10%，說(shuō)明建立的模型對(duì)粒徑及其分布系數(shù)，載藥量和包封率均具有較好的預(yù)測(cè)能力。

4.2 從圖4可知，在1 h內(nèi)，CST的累積釋放度能達(dá)到90.2%，而SRL-NLC分散液在4 h時(shí)累積釋放度為9.3%，且120 h內(nèi)的累積釋放量也較CST低，分析原因是:首先，SRL從NLC中溶出需借助脂質(zhì)載體的緩慢溶蝕而釋放出來(lái)，藥物釋放速率較慢，故SRL-NLC分散液的釋放速率較CST慢;其次，溶出的SRL除一部分透析外，還有一部分可能在SDS的作用下再次與脂質(zhì)形成乳滴，因此SRLNLC分散液的累積釋放度較低，僅為60.1%;最后，由于脂質(zhì)載體經(jīng)口服后，在刺激淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)的同時(shí)也能刺激膽汁和消化酶的分泌，消化酶能分解脂質(zhì)載體釋放出其中的藥物，膽汁中膽鹽，磷脂等內(nèi)源性表面活性劑能起到增溶藥物的作用，因此與SRL-NLC借助粒徑小分布廣，比表面積大這種“主動(dòng)”增溶的作用［2］相比，利用脂質(zhì)消化過(guò)程中產(chǎn)生內(nèi)源性表面活性劑“被動(dòng)”增溶的作用也是NLC改善難溶性藥物溶解度和溶出度的重要機(jī)制，這對(duì)于提高難溶性藥物的“向水性”，增加其口服吸收具有重要意義［6］，因此，在0.4%SDS溶液中體外釋放度的多少和釋放時(shí)間的長(zhǎng)短并不能完全評(píng)價(jià)NLC對(duì)SRL的增溶能力。CST是將SRL的納米結(jié)晶均勻噴灑在空白乳糖片心上制得，所以漏槽條件是該制劑體外釋放度的決定因素，這與SRL-NLC的體外釋藥機(jī)制不完全相同。SRL-NLC分散液在0.4%SDS溶液中的體外溶出度試驗(yàn)僅是SRL-NLC體外評(píng)價(jià)方法的一個(gè)初步探討，可為后期建立SRL-NLC固體制劑體外評(píng)價(jià)方法提供參考和借鑒。

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