鐘 山 高 云 孫銘娟 楊生生 張建鵬 王梁華

第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海 200433

《生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》的動(dòng)態(tài)教學(xué)初探

鐘 山 高 云 孫銘娟 楊生生 張建鵬 王梁華

第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海 200433

生物化學(xué)與分子生物學(xué)是一門醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課程，為了進(jìn)一步提供學(xué)生在實(shí)驗(yàn)課中的學(xué)習(xí)效果，本研究初探《生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》的教學(xué)內(nèi)容重新編排，發(fā)現(xiàn)能更大的調(diào)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性，理論掌握與動(dòng)手能力得到提高。

生物化學(xué)；分子生物學(xué)；動(dòng)態(tài)教學(xué)

現(xiàn)代生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不僅推動(dòng)了分子生物學(xué)理論在廣度和深度2個(gè)方面的進(jìn)展[1]，同時(shí)以基因工程為主導(dǎo)的生化與分子生物學(xué)技術(shù)，也已經(jīng)進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段，并推動(dòng)著社會(huì)生產(chǎn)力的發(fā)展[2]。鑒于現(xiàn)代生物化學(xué)與分子生物學(xué)新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，熟練掌握其實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，就成為生命科學(xué)工作者包括醫(yī)療工作者的基本素質(zhì)要求，而實(shí)驗(yàn)教學(xué)是整個(gè)《生化與分子生物學(xué)》教學(xué)過程的重要環(huán)節(jié)[3]。本研究通過對(duì)實(shí)驗(yàn)課學(xué)生反饋與課程技術(shù)討論總結(jié)，從生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的培養(yǎng)目標(biāo)出發(fā)，針對(duì)目前第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的現(xiàn)狀，以及傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式顯露出來的弊端進(jìn)行分析，提出以下實(shí)驗(yàn)課程改革方案。

1 跳出理論與實(shí)踐分離的教學(xué)模式

新課程，新理念，要求新的學(xué)習(xí)方法。先理論后實(shí)踐，圍繞分子生物學(xué)技術(shù)的基本過程，以人腫瘤壞死因子α（TNFα）在大腸桿菌中表達(dá)為主線，以“分、切、接、轉(zhuǎn)、篩”五大步驟展開。第一節(jié)介紹抽提組織細(xì)胞的核酸，并以此為模板，利用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）或反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）的方法分離其編碼DNA序列，即目的基因的獲得（目的基因的“分”）；第二節(jié)為分離純化質(zhì)粒的各種方法，即載體的獲得（載體的“分”），然后目的基因與載體分別進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶的酶切及回收與鑒定，即“切”；第三節(jié)為目的基因與載體以連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并以質(zhì)粒所帶的篩選標(biāo)志進(jìn)行篩選，即“接”“轉(zhuǎn)”與“篩”。第四節(jié)對(duì)重組子進(jìn)一步篩選，通過誘導(dǎo)表達(dá)重組子編碼的產(chǎn)物（人TNFα），然后進(jìn)行分離鑒定重組蛋白質(zhì)，這是根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)一步“篩”；以及以蛋白質(zhì)電泳（SDS-PAGE）為基礎(chǔ)，從表達(dá)產(chǎn)物的分子量，免疫學(xué)性質(zhì)、殺傷腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性等方面進(jìn)一步分析與鑒定重組表達(dá)產(chǎn)物，也是“篩”的過程。

2 導(dǎo)引曲徑，由理論回到實(shí)驗(yàn)

圍繞思維目標(biāo)，指引思維的“曲徑”，這“曲徑”實(shí)際上是指不同角度、不同層次的思維指向。教學(xué)中，讓學(xué)生沿著“曲徑”逐層“探幽”，促其對(duì)思維目標(biāo)的深層感悟，并從中引出實(shí)驗(yàn)課教學(xué)的重點(diǎn)-實(shí)驗(yàn)原理及操作。

2.1 第一節(jié)課：理論教授內(nèi)容：TNF家族簡(jiǎn)介

（1）TNF配體及受體超家族基因結(jié)構(gòu)特征：復(fù)習(xí)內(nèi)含子，外顯子，單拷貝基因，基因家族；（2）TNF配體及受體超家族分子結(jié)構(gòu)：復(fù)習(xí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次，跨膜蛋白（Ⅰ、Ⅱ型），信號(hào)肽；（3）TNF配體及受體超家族結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系：凋亡（形態(tài)、分子標(biāo)志，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程），壞死；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)（蛋白質(zhì)聚集，剪切，磷酸化等修飾）（重點(diǎn)）。

帶著理論中存在的實(shí)驗(yàn)問題，回到實(shí)驗(yàn)中去掌握具體的實(shí)驗(yàn)原理及操作。（1）PCR原理：DNA合成，3步反應(yīng)循環(huán)；（2）引物（探針）設(shè)計(jì)原理：11條，結(jié)合TNF可溶性編碼序列的擴(kuò)增引物講解（重點(diǎn)）；（3）PCR擴(kuò)增體系：各組分（特別是dNTP、Mg、Taq酶），濃度，純度要求，使用時(shí)注意點(diǎn)；（4）PCR擴(kuò)增條件：溫度、循環(huán)次數(shù)，各種類型PCR儀簡(jiǎn)介；（5）PCR衍生技術(shù)（T-A克隆、RT-PCR、熒光定量PCR等）和用途。

2.2 第二節(jié)課：理論教授內(nèi)容

（1）質(zhì)粒：概念，質(zhì)粒不相容性；嚴(yán)緊性與松弛型質(zhì)粒差別的基礎(chǔ)；其他常用載體（重點(diǎn)）；（2）限制性內(nèi)切酶：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ特征，Ⅱ型詳介（回文結(jié)構(gòu)、粘端、平端、同尾酶）（重點(diǎn)）；酶切圖譜；（3）連接酶：T4 DNA連接酶，其他連接酶；（4）其他工具酶；（5）定向克?。唬?）細(xì)胞組分。同時(shí)對(duì)應(yīng)本節(jié)帶出的要掌握實(shí)驗(yàn)操作：（1）質(zhì)粒抽提試劑盒原理、各溶液組分和作用，操作要點(diǎn)（重點(diǎn)）；（2）限制性內(nèi)切酶反應(yīng)條件，使用注意事項(xiàng)（甘油影響，質(zhì)粒純化時(shí)酒精殘余的影響）；（3）凝膠回收試劑盒原理、各溶液組分和作用，操作要點(diǎn)；（4）連接酶反應(yīng)條件，使用注意事項(xiàng)（徹底融化和溶解，溫度，膠回收純化時(shí)酒精殘余的影響）；（5）電泳詳解：各類電泳（瓊脂糖凝膠電泳，薄膜電泳，SDSPAGE等，水平式、垂直、管狀、脈沖等）原理；核酸電泳操作要點(diǎn)（凝膠濃度，核酸濃度測(cè)算，分子量測(cè)算），適用范圍，注意事項(xiàng)（重點(diǎn)）。（6）細(xì)胞組分分離：破碎細(xì)胞方法（物理方法：反復(fù)凍融，超聲，（高壓）勻漿；化學(xué)方法：酸解，堿裂解（質(zhì)粒抽提）；生物方法：各種酶解）。

2.3 第三節(jié)課：理論教授內(nèi)容

（1）外源基因?qū)胨拗鞣绞剑ń雍?，轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)導(dǎo)，感染等）；感受態(tài)；（2）重組子篩選原理（質(zhì)粒-抗性、生化標(biāo)志，外源DNA片段，表達(dá)產(chǎn)物）。同時(shí)對(duì)應(yīng)本節(jié)帶出的要掌握的實(shí)驗(yàn)操作：（1）轉(zhuǎn)化（CaCl2法）：操作要點(diǎn)：恒低溫（0℃）保持，復(fù)蘇溫度與時(shí)間；（2）藍(lán)白斑篩選。

2.4 第四節(jié)課：理論教授內(nèi)容

（1）蛋白質(zhì)的哪些性質(zhì)可作為蛋白質(zhì)分離純化的依據(jù)？（2）重組蛋白表達(dá)的特性（包涵體的形成，融合表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)）；（3）抗體簡(jiǎn)介：結(jié)構(gòu)，類型（一抗，二抗；單抗，多抗，抗血清；（酶、熒光等）標(biāo)記抗體）；（4）蛋白質(zhì)功能研究策略。

同時(shí)對(duì)應(yīng)本節(jié)帶出的要掌握實(shí)驗(yàn)操作：（1）鹽析：原理；分段鹽析；（2）離心技術(shù)詳解：轉(zhuǎn)速（超速），離心力；密度梯度離心；差速離心；溫度，真空度；（3）層析：分子篩（分子量測(cè)算，純度測(cè)算）（重點(diǎn)）；其他方法（離子層析，親和層析，反相，HPLC等）；方法的選擇；（4）SDS-PAGE（分子量測(cè)算，純度測(cè)算）（重點(diǎn)）；Western-blot分析：操作要點(diǎn)（膜，電轉(zhuǎn)移，封閉，顯色：底物，化學(xué)發(fā)光，熒光）；（5）活性測(cè)定：分子相互作用分析；酶活性分析，細(xì)胞功能分析，動(dòng)物模型分析。

2.5 第五節(jié)課：總復(fù)習(xí)

（1）分子克隆原理與流程總結(jié)；（2）基因功能研究策略：表達(dá)；表達(dá)調(diào)控；產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）結(jié)構(gòu)，理化性質(zhì)鑒定，相互作用，功能研究。

3 開放教學(xué)，注重思考

在教學(xué)中采用的是以小組為單位進(jìn)行討論，開展實(shí)驗(yàn)探索活動(dòng)，以培養(yǎng)學(xué)生的探究能力。每節(jié)理論與操作課完成后預(yù)留部分時(shí)間，讓學(xué)生帶著思考回顧內(nèi)容，在討論中，每個(gè)成員是平等的，可以自由地發(fā)表個(gè)人的見解，通過討論可以集思廣益，互相合作，加速知識(shí)的同化。

3.1 第一節(jié)課思考題

（1）PCR時(shí)降低退火溫度對(duì)反應(yīng)有何影響？（2）PCR時(shí)延長(zhǎng)變性時(shí)間對(duì)反應(yīng)有何影響？（3）PCR時(shí)循環(huán)次數(shù)是否越多越好？為什么？（4）PCR時(shí)如果出現(xiàn)非特異性帶，可能有哪些原因？（5）如要闡述某蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)與功能，應(yīng)如何展開？

3.2 第二節(jié)課思考題

（1）質(zhì)粒的基本性質(zhì)有哪些？（2）質(zhì)粒載體與天然質(zhì)粒相比有哪些改進(jìn)？（3）在堿法提取質(zhì)粒DNA操作過程中應(yīng)注意哪些問題？（4）如果一個(gè)DNA酶解液在電泳后發(fā)現(xiàn)DNA未被切動(dòng)，你認(rèn)為可能是什么原因？（5）瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響？（6）設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來判斷雙酶切時(shí)，證實(shí)2個(gè)限制性內(nèi)切酶都起到了作用。

3.3 第三節(jié)課思考題

（1）制備感受態(tài)細(xì)胞的原理是什么？（2）如果實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組本不該長(zhǎng)出菌落的平板上長(zhǎng)出了一些菌落，你將如何解釋這種現(xiàn)象？（3）在用質(zhì)粒載體進(jìn)行外源DNA片段克隆時(shí)主要應(yīng)考慮哪些因素？

4 討論

生物化學(xué)與分子生物學(xué)是一門基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)學(xué)科[4]，學(xué)生經(jīng)過對(duì)理論學(xué)習(xí)對(duì)生化與生物化學(xué)的研究?jī)?nèi)容及研究手段有了深入的理解，此時(shí)需要更進(jìn)一步的深入，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)操作技能的學(xué)習(xí)與掌握，能夠利用分子生物學(xué)手段解決實(shí)際的實(shí)驗(yàn)問題。

本實(shí)驗(yàn)課程改革正處于一個(gè)初步探索的階段，通過學(xué)生的反饋調(diào)查，新教學(xué)方法受到了同學(xué)們的歡迎，總體上體現(xiàn)在：注意力更加集中，運(yùn)用了理論與實(shí)驗(yàn)操作結(jié)合學(xué)習(xí)，減輕了學(xué)生純理論學(xué)習(xí)的枯燥乏味的“填鴨式”教育；帶著問題學(xué)習(xí)技術(shù)，本教學(xué)摒棄了傳統(tǒng)上孤立的純實(shí)驗(yàn)技術(shù)學(xué)習(xí)，而是采用帶著問題，解決問題，圍繞分子生物學(xué)技術(shù)的基本過程，以人腫瘤壞死因子α（TNFα）在大腸桿菌中表達(dá)為主線，以“分、切、接、轉(zhuǎn)、篩”五大步驟展開；及時(shí)溫故，經(jīng)過理論與操作技能的學(xué)習(xí)，還預(yù)留部分時(shí)間讓學(xué)生對(duì)思考題進(jìn)行討論，有利于集思廣益，互相合作，加速知識(shí)的同化。

總之，通過對(duì)生化實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改革，學(xué)生對(duì)生化實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了濃厚的興趣，參與實(shí)驗(yàn)的自覺性和積極性得到有效提高，提高了實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量。

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[2] 吳小梅，蘇建友，周亞軍，等.關(guān)于提高醫(yī)學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量的思考[J].交通醫(yī)學(xué)，2008，22（2）：209-210．

[3] 卜友泉，廖飛，王詠梅，等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革初探[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育版），2008，10（5）：570-572．

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