陳 蕾 許麗艷

1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，廣東汕頭 515031；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤病理研究室，廣東汕頭 515031

晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌血漿MMP-2、MMP-9檢測與化療療效相關(guān)性研究

陳 蕾1許麗艷2

1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，廣東汕頭 515031；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤病理研究室，廣東汕頭 515031

目的探討血漿基質(zhì)金屬蛋白酶活性與晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌化療療效的相關(guān)性。方法 選擇經(jīng)病理或細(xì)胞學(xué)確診的晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，分別于化療前后收集患者血漿（1.8 mL空腹全血加0.2% mL枸櫞酸鈉），離心后放置于-70℃冰箱凍存?zhèn)洳?。用酶譜法測定腫瘤患者血漿MMP-2及MMP-9的活性，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析；以白色條帶的凈光密度值相對定量樣品中酶的活性。 結(jié)果 MMP-2、MMP-9在晚期乳腺癌治療前后的活性水平測定具有統(tǒng)計學(xué)意義。（P＜0.05）。 結(jié)論 晚期乳腺癌患者血漿MMP-2、MMP-9活性與病情進(jìn)展和療效有一定相關(guān)性，而檢測方法簡單經(jīng)濟(jì)，具有一定的臨床指導(dǎo)價值。

晚期乳腺癌；基質(zhì)金屬蛋白酶；化療

多項(xiàng)臨床及基礎(chǔ)研究表明腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶（（matrix metaiioproteinases，MMPs） 的能力有關(guān)。為探討血漿金屬蛋白酶活性與轉(zhuǎn)移性乳腺癌化療療效的相關(guān)性，對轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者化療前后的血漿MMP-2、MMP-9進(jìn)行檢測，以了解化療對轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者血漿MMP-2、MMP-9的活性影響，從而確定血漿MMP-2、MMP-9檢測與轉(zhuǎn)移性乳腺癌化療療效的相關(guān)性。筆者所在科室2004年7月開始對部分晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者進(jìn)行血液標(biāo)本的收集，并用酶譜法（Zymography）測定患者血漿MMP-2及MMP-9的活性，現(xiàn)將部份結(jié)果資料報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

入組32例病例均為筆者所在科室2004年7月～2006年7月收治的患者，所有病例均是經(jīng)病理或細(xì)胞學(xué)確診的晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者?；颊呔鶠榕?，其中Ⅳ期24例，Ⅲ期8例。患者均為腋窩淋巴結(jié)陽性，其中第1次就診腋窩淋巴結(jié)3個以內(nèi)的2例，腋窩淋巴結(jié)3～8個的23例，8個以上的6例，腋窩淋巴結(jié)情況不明的1例；肺轉(zhuǎn)移9例，骨轉(zhuǎn)移12例，腦轉(zhuǎn)移6例，肝轉(zhuǎn)移3例，胸壁、皮膚等其他部位多發(fā)轉(zhuǎn)移9例?；颊吣挲g32～68歲，中位年齡48歲。患者使用的化療方案包括TP、NP、GL-OHP、CAP等，所有入組患者均予2個療程以上的2線或3/4線聯(lián)合或單藥方案化療。隨訪至2009年12月死亡24例，帶瘤生存7例，無復(fù)發(fā)生存1例（為胸壁轉(zhuǎn)移無復(fù)發(fā)者）?？傆行蕿?9.4%（CR+PR：19/32），腫瘤控制率為75.0%（CR+PR+SD：24/32），無法評價 9.3%（3/32）。

1.2 MMP-2、MMP-9活性測定

分別于化療前后收集患者血漿（1.8 mL空腹全血加0.2% mL枸櫞酸鈉），3000 r/min離心后放置于-70℃冰箱凍存?zhèn)洳?。用酶譜法測定腫瘤患者血漿MMP-2及MMP-9的活性；用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析結(jié)果：以白色條帶的凈光密度值相對定量樣品中酶的活性。

試劑：人血漿MMP-2和MMP-9酶聯(lián)免疫吸收試劑盒試劑均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)操作按照說明書操作。

試劑：1.0 mol/L Tris-HCl、10%SDS 、10% 過硫酸胺（AP）、1.5 mol/L Tris.HCl（pH8.8）、0.5 mol/LTris.HCl（pH6.8）、0.25%bromophenol blue（溴 酚 藍(lán)）、1% gelatin（明 膠）、2xSDS樣 品 緩 沖 液（1.0mol/LTris-Cl，pH6.8，20%glycerol，2%SDS，0.02% bromophenol blue SDS-PAGE，1.0 mol/L Tris-HCl，pH7.5）、10%Triton X-100 洗滌緩沖液（50mM Tris-HCl， pH7.5，2.5%Triton X-100）、孵育緩沖液（50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCI and CaCl2） 0.1%Coomassic Blue（考馬斯蘭染液）脫色液。

樣品制備：患者血漿適量直接與2XSDS樣品緩沖液等體積混勻進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

電泳：將制備好的樣品置于37℃水浴中孵育30 min，稍離心后上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

電泳結(jié)束后，取下凝膠，放入平皿中，用洗滌緩沖液在室溫?fù)u動下洗滌1 h，其間換液一次。然后加入孵育緩沖液沒過膠面，用保鮮膜保好平皿，至37℃恒溫箱中，其間換液一次，24 h后取出，棄去孵育緩沖液，加入0.1%考馬斯蘭染液染色約30 min，回收染液，加入脫色液脫色至藍(lán)色背景和白色條帶均十分明顯時，用5%乙酸中止脫色。干燥封膠。

用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析結(jié)果：以白色條帶的凈光密度值相對定量樣品中酶的活性。

圖1 MMP-9、MMP-2電泳圖

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

MMP-2、MMP-9在晚期乳腺癌的治療前后的活性水平測定具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 MMP-2、MMP-9治療前后的活性比較（±s，μg/mL）

表1 MMP-2、MMP-9治療前后的活性比較（±s，μg/mL）

注：與治療前比較，*P=0.023；**P=0.019

組別 n MMP-2 MMP-9治療前 32 33.549 0±15.371 1 17.942 0±12.093 9治療后 32 22.276 3±16.537 9 * 10.792 0±8.881 1**

3 討論

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是多階段、多步驟、多因素和多基因等綜合作用和發(fā)展的過程。在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中會遇到一系列的組織屏障，這些屏障由細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中的基底膜及間質(zhì)、基質(zhì)所組成，不同的基質(zhì)成分是由不同的蛋白水解酶（proteolytic enzymes）降解的。水解酶來自瘤細(xì)胞自身分泌，也可由局部宿主細(xì)胞受誘導(dǎo)而分泌，還可以是基質(zhì)內(nèi)原本存在的酶前體激活所致。腫瘤細(xì)胞通過其表面受體與細(xì)胞外基質(zhì)成分粘附后， 激活和釋放各種蛋白水解酶降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，為腫瘤細(xì)胞的移動形成通路。而基質(zhì)金屬蛋白酶則是一類與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白水解酶，同時它也是一個鋅離子依賴的蛋白酶家族，目前已證實(shí)至少有17個亞型，明膠酶是MMPs家族中主要成員之一，分為2個亞型即MMP-2 （72 kD，明膠酶A）和MMP-9（92kD，明膠酶B）[1-2]。MMP-2對基膜主要成分Ⅳ型膠原和層粘連蛋白的降解作用是其喪失完整性的主要原因。MMP-2一方面通過降解基底膜和包繞腫瘤的基質(zhì)，突破基質(zhì)屏障，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，另一方面通過毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、新生血管生成等促進(jìn)腫瘤生長和擴(kuò)散。 MMP-9對于基底膜中的Ⅳ型膠原蛋白有專一的降解作用，基底膜中的膠原蛋白被降解，其結(jié)構(gòu)即遭破壞，從而失去對腫瘤細(xì)胞的阻隔作用。因大部分的MMPs不是直接的活性形式，而是作為無活性的酶原形式，在適當(dāng)?shù)臈l件下被激活釋放，破壞細(xì)胞外基質(zhì)[3-5]。美國學(xué)者Stella Maris Ranuncolo等[6]報道血漿基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）與乳腺癌患者疾病狀態(tài)具有相關(guān)性，其研究顯示血漿MMP-9可能成為臨床指導(dǎo)乳腺癌治療的重要預(yù)后指標(biāo)。國內(nèi)學(xué)者也進(jìn)行乳腺癌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶活性測定的研究，結(jié)果顯示，乳腺癌組織中MMP-2、MMP-9的活性顯著高于纖維腺瘤；而乳腺癌患者中，浸潤性癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的MMP-2、MMP-9的活性顯著高于非浸潤性癌及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，從而證實(shí)MMP-2、MMP-9的活性部分與乳腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)[7]。何旭等[8]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織MMP-2的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，MMP-2的表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分型、臨床分期無關(guān)，而與組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。李紅梅等[9]研究發(fā)現(xiàn)MMP-13的表達(dá)提示乳腺導(dǎo)管癌局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)會增加，基于上述研究，筆者試圖用酶譜分析法測得晚期乳腺癌患者化療前后的血漿MMPs，并探討結(jié)果是否有臨床指導(dǎo)意義，因?yàn)檠獫{MMPs是潛在活性的MMPs，它是活化型MMPs的儲存方式。經(jīng)取晚期乳腺癌患者化療前后的血漿，檢測MMP-2及MMP-9水平，實(shí)驗(yàn)測得的MMPs活性數(shù)據(jù)采用配對t檢驗(yàn)，結(jié)果表明MMP-2、MMP-9在晚期乳腺癌患者治療前后的活性水平表達(dá)存在著統(tǒng)計學(xué)差異，且治療后的活性水平表達(dá)比治療前減少（P＜0.05）。從而推斷化療藥物可以降低腫瘤細(xì)胞中的MMP-2、MMP-9水平，從而達(dá)到減緩腫瘤生長和抑制擴(kuò)散的作用，這也是化療有效的客觀指標(biāo)之一。由于本研究取得的樣本數(shù)量較少，說服力還較差，因此在未來的臨床研究中，有必要進(jìn)一步探討大組晚期乳腺癌患者的血漿動態(tài)MMP-2、MMP-9水平與病情進(jìn)展和總生存的相關(guān)性，也為晚期乳腺癌患者的治療觀察增加的一項(xiàng)分子檢測指標(biāo)。

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Correlational study on advanced metastatic breast cancer plasma MMP-2,MMP-9 detection and the curative effect of chemotherapy

CHEN Lei1XU Liyan2
1.Affiliated Cancer Hospital of Shantou University Medical College,Shantou 515031,China;2.Pathology Laboratory,Affiliated Cancer Hospital of Shantou University Medical College,Shantou 515031,China

Objective To evaluate the bioactivity of plasmatic MMPsand their relevance with chemotherapeutic efficacy in patients with advanced metastatic breast cancer.Methods Plasma samples of patients with pathological or cytological confirmed advanced metastatic breast cancer were collected before and after chemotherapy.The Zymography method was used to determine the bioactivity of MMP-2 and MMP-9,followed by systemic analysis with gel imaging procedure.The optic density of white band was taken as the corresponding bioactivity of quantitative samples.Results The level of MMP-2,MMP-9 in the activity of advanced breast cancer before and after treatment were statistically significant(P＜0.05).Conclusion The bioactivity of MMP-2 and MMP-9 in plasma in patients with MBC before and after chemotherapy has a certain relationship with disease progression and chemotherapeutic efficacy.The detective method is economic and have clinical guidance value.

Advanced breast cancer;Matrix metalloproteinases;Chemotherapy

R737.9

A

2095-0616（2012）01-15-03

廣東省汕頭市重點(diǎn)科技計劃項(xiàng)目（汕府科[2004]102號）。

2011-10-28）