苑廣志

（遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，遼寧營口115009）

乳酸是重要的生物化工產(chǎn)品，廣泛用于醫(yī)藥、食品、飲料、日用化工、石油化工、皮革、卷煙工業(yè)等領域[1-4]。特別是近年來開發(fā)出的L－乳酸的聚合物，可生產(chǎn)生物降解的農(nóng)用地膜及其它塑料制品代替無法降解的常用塑料，能解決全球的“白色”污染問題[5-6]。乳酸有廣闊的國內外市場。

目前乳酸的生產(chǎn)方法主要有化學合成法，酶法[7]和發(fā)酵法?；瘜W合成法由于所用的原料是乙醛和劇毒物質氫氰酸，因而合成法生產(chǎn)乳酸大大受到限制，其生產(chǎn)成本也較高。酶法生產(chǎn)乳酸雖然可以專一性得到旋光乳酸，但工藝比較復雜，應用到工業(yè)上還有待于進一步研究。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸，可通過菌種和培養(yǎng)條件的選擇而得到具有專一性的D 乳酸、L－乳酸或是DL－乳酸。且乳酸菌具有發(fā)酵溫度高，產(chǎn)酸率相對較高，對糖利用率高，發(fā)酵時不需通氧氣等優(yōu)點，因此發(fā)酵法具有非常廣闊的前景[8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌種

耐堿菌：LP3－3，中科院微生物研究所提供。

1.1.2 主要儀器

P/ACE MDQ 毛細管電泳儀：Beckman 公司（美國），配有二極管陣列檢測器；熔融石英毛細柱：40 cm（有效長度為37 cm×50 μm I.D）；ZD-2 自動電位滴定儀、UV2450 紫外分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；TJL-16G 臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；THZ-82（A）數(shù)顯水浴恒溫振蕩器：金壇市順華儀器有限公司廠；LRH-150 生化培養(yǎng)箱、ZHWY-211C 恒溫培養(yǎng)振蕩器、ZHJH-1112 垂直流超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；XS-212 生物顯微鏡：重慶光學儀器廠。

1.1.3 主要試劑

試劑：磷酸（大于85%）；十六烷基三甲基溴化胺；蘋果酸；琥珀酸；草酸；檸檬酸；酒石酸；甲酸；乙酸；丙酸；乳酸。以上各有機酸均為分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基1 000 mL 中各營養(yǎng)成分比例如下（單位：g）：葡萄糖50.0，胰蛋白胨2.0，酵母膏10.0，蛋白胨4.0，乙酸鈉（無水）2.0，檸檬酸三銨2.0，K2HPO4·H2O 2.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnCl2·4H2O 0.05，吐溫-80 1，NaCl 40，用10%的Na2CO3調pH，初始pH 為9.0。滅菌條件為110 ℃，25 min。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化

分別對該菌株的發(fā)酵條件如接種量、pH、溫度進行優(yōu)化。

1.2.1.1 接種量對發(fā)酵的影響

用較大的接種量可以縮短延遲期，從而縮短發(fā)酵周期，但有時也會造成菌體的早衰，導致發(fā)酵后勁不足。這里分別使用1%、3%、5%、8%、10%的接種量以優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基采用35 ℃，200 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，定期取樣品測定OD600值及乳酸的產(chǎn)量。

1.2.1.2 初始pH 的優(yōu)化

培養(yǎng)基的初始pH 會影響菌體的生長和代謝流的分布，在1.2.1.1 試驗基礎上分別對初始pH 為6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0 的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基在35 ℃，200 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，定期取樣品測定OD600值及乳酸的產(chǎn)量。

1.2.1.3 溫度的優(yōu)化

溫度對菌體生長和酶的活性有顯著影響，因此在1.2.1.2 試驗基礎上分別對培養(yǎng)溫度為20、25、30、35、40 ℃的菌株的發(fā)酵情況進行測定。

1.2.2 乳酸的檢測

1.2.2.1 毛細管電泳的操作條件

分離電壓：負電壓，8 kV；壓力進樣：3.45×103Pa，時間6 s；柱溫：25 ℃；紫外檢測波長：200 nm；為優(yōu)于進樣，2 次進樣之間用0.5 mol/L NaOH 水溶液沖洗2 min，再用雙蒸水沖洗2 min，最后用500 mmol/L磷酸緩沖液沖洗2 min。

1.2.2.2 毛細管電泳的檢測方法

用去離子水分別配制1 g/L 的蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、草酸、甲酸、乙酸、丙酸、乳酸標準溶液。將各有機酸標準溶液在相同的電泳條件下依次進行分析，得到各有機酸的遷移時間，依次來決定混合標準液中各個物質的出峰順序。在1.2.2.1 的操作條件下，以各有機酸的峰面積A 對濃度C 進行線性回歸，得到各物質的線性回歸方程并繪制出標準曲線。在相同的色譜條件下測定發(fā)酵液中乳酸的含量。

1.2.2.3 實際發(fā)酵液樣品的檢測

將實際發(fā)酵液在8 000 r/min 轉速下離心20 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 針筒式水膜過濾器過濾后，直接取樣進行檢測。

1.2.3 測定方法

菌液OD：采用UV2450 紫外分光光度計在600 nm下測定；乳酸檢測：采用毛細管電泳法。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵條件對于乳酸產(chǎn)量的影響

2.1.1 接種量對乳酸產(chǎn)量的影響

接種量對乳酸產(chǎn)量的影響試驗結果如圖1。

由圖1 可以看出：接種量小于5 %時，隨著接種量的增加，產(chǎn)生的乳酸量也在相應增加，但當接種量超過5 %后，乳酸量反而下降，說明采用較大的接種量可以縮短菌體繁殖達到高峰的時間，但如果接種量過多，往往使菌體生長過快過多，營養(yǎng)物質迅速消耗，菌體早衰，造成發(fā)酵后勁不足，從而影響產(chǎn)酸量；而接種量過小，除了延長發(fā)酵周期外，往往還會引起其它不正長常的情況。綜合以上因素確定采用接種量為5 %。

2.1.2 初始pH 對乳酸產(chǎn)量的影響

發(fā)酵過程中培養(yǎng)液的pH 是菌體在一定環(huán)境下代謝活動的綜合指標，是一個重要的發(fā)酵參數(shù)，它對于菌體的生長和產(chǎn)品的積累有很大的影響。初始pH 對乳酸產(chǎn)量的影響試驗結果如表1 和圖2 所示。

表1 初始pH 對乳酸菌生長的影響Table 1 Effect of pH on growth of LP3-3

由表1 可知，隨著初始pH 的增加，菌體的生長速率逐漸變快，而初始pH6～8 時，菌體只有少量生長；從時間來看符合菌種生長的趨勢，即在24 h 已處在穩(wěn)定期，從24 h～34 h 是積累代謝產(chǎn)物的過程。從圖2 中可以看出：初始pH6～8 時，只有少量乳酸產(chǎn)生，而從24 h～34 h，初始pH 為9，10，11 的發(fā)酵液中的乳酸量都在相應增加，且pH9 的乳酸產(chǎn)量明顯高于其他。綜合以上數(shù)據(jù)選擇初始pH 為9。

2.1.3 溫度對乳酸產(chǎn)量的影響

溫度是影響有機體生長與存活的最重要因素之一。它對生活機體的影響表現(xiàn)在兩方面：一方面隨著溫度的上升，細胞中的生物化學反應速率和生長速率加快；另一方面，機體的重要組成如蛋白質、核酸等對溫度都比較敏感，隨著溫度的增高而可能遭受不可逆的破壞。在最適溫度下，菌種可以獲得最佳的生長效果，在最適溫度下，也可獲得最佳的產(chǎn)物量，因此確定發(fā)酵的最適溫度，對提高乳酸產(chǎn)量至關重要。試驗結果如圖2 和表2 所示。

表2 溫度對菌體生長的影響（34 h）Table 2 Effect of temperature on grow of LP3-3

由表2 可知，30 ℃、35 ℃菌體的生長較好，且30 ℃是其最適生長溫度，而25 ℃、40 ℃其生長受抑制。綜合圖3 可以得出結論：盡管30 ℃是其最適生長溫度，但其產(chǎn)酸最適溫度為35 ℃。因此采用35 ℃作發(fā)酵溫度，而30 ℃作為種子培養(yǎng)溫度。

2.2 乳酸檢測方法的建立

2.2.1 毛細管電泳操作條件的選擇

2.2.1.1 檢測波長的選擇

在全波長范圍內掃描發(fā)現(xiàn)，9 種有機酸在200 nm左右都有最大吸收，為得到均衡的靈敏度，實驗選擇200 nm 為檢測波長。

2.2.1.2 操作電壓的影響

改變電壓從6 kV～12 kV，9 種有機酸的遷移時間逐漸減少。此外，隨著電壓的增大，電泳電流增加，各峰峰形變的尖銳，分離效率提高，但產(chǎn)生的焦耳熱增多，導致區(qū)帶增寬，分離度下降。因此選擇電壓為8 kV。

2.2.1.3 進樣時間的影響

固定3.45×103Pa 壓力進樣，3 s～10 s 區(qū)間改變進樣時間。進樣時間越長，靈敏度越高，但溶質區(qū)帶加寬，分離度降低；然而進樣時間越短，會使峰電流響應太小，峰高重現(xiàn)性得不到保證。故選擇進樣時間為6 s。

2.2.1.4 電泳溫度的影響

考察了15 ℃～30 ℃間9 種有機酸的分離情況。結果表明，隨著溫度的升高，電流增大，遷移時間縮短，但同時會產(chǎn)生更多的焦耳熱，導致分離度下降。為了兼顧分析時間和分離度，選擇電泳溫度為25 ℃。

2.2.1.5 緩沖液濃度對有機酸分離的影響

分別用不同濃度（400 mmol/L、500 mmol/L、600 mmol/L）的磷酸緩沖液對9 種有機酸進行分離，實驗發(fā)現(xiàn)，3 種濃度的緩沖液對遷移時間的影響不大，但當濃度增大為600 mmol/L 時，9 種有機酸的分離效果不太理想，前2 種有機酸重合在一起，沒有分離開，而且還有一種有機酸在此濃度下沒有信號，如圖4 所示。

由圖4 可知，在400 mmol/L 和500 mmol/L 濃度條件下，9 種有機酸分離較好，因此，本實驗選擇濃度為400 mmol/L 和500 mmol/L 均可。

2.2.1.6 緩沖液pH 對有機酸分離的影響

有機酸為弱酸，其pKa值大多在2～6 之間，因此有機酸的有效遷移率的大小在很大程度上取決于緩沖液的pH。在緩沖液pH分別為5.50、5.75、6.00、6.25、6.50 的條件下，對9 種有機酸進行分離，實驗結果見圖5。

由圖5 可知，當pH 小于6 時，這幾種有機酸不能完全分離，因此最終選取pH 為6.25。

2.2.2 有機酸的定性與定量分析

2.2.2.1 有機酸的定性分析

將各有機酸標準溶液在相同的電泳條件下依次進樣分析，得到各有機酸的遷移時間，與混合標準液進樣后的譜圖比較，從而確定各種有機酸的出峰順序，見圖6。

由各標準有機酸的遷移時間可得到出峰順序依次為：蘋果酸、甲酸、琥珀酸、草酸、酒石酸、檸檬酸、乙酸、丙酸、乳酸。其中乳酸標準品的譜圖見圖7。

2.2.2.2 有機酸的定量分析

在最優(yōu)化的色譜操作條件下，以各有機酸的峰面積A 對濃度C 進行線性回歸，得到各物質的線性回歸方程及線性范圍、相關系數(shù)。定量參數(shù)見表3。

表3 各有機酸的定量參數(shù)Table 3 Analytical characteristics of the method

由表3 可見無論從定量精度還是靈敏度均可滿足分析要求。

2.2.3 實際發(fā)酵液樣品的檢測

將實際發(fā)酵液在8 000 r/min 轉速下離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm 針筒式水膜過濾器過濾后，直接取樣100 μL 進行檢測。實際樣品檢測結果見圖8 及圖9。

從圖中也可看出隨著時間推移，乳酸的含量逐漸增多，同時伴有其他有機酸的代謝。而且整個分離過程在10 min 內基本完成，所以此方法完全可用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)有機酸過程中的在線監(jiān)測。

3 結論與展望

1）通過單因素試驗，確定了搖瓶發(fā)酵最佳條件為：接種量為5%，溫度為35 ℃，初始pH 為9.0。

2）出發(fā)菌種產(chǎn)乳酸為10.019 g/L，而在最佳發(fā)酵條件下，34 h 產(chǎn)乳酸量為16.267 g/L，比原來提高乳酸產(chǎn)量62.4%，達到了較好的篩選效果。

3）建立了毛細管電泳檢測乳酸的方法。即操作條件為檢測波長為200 nm，操作電壓為8 kV，進樣時間為6 s，電泳溫度為25 ℃，磷酸緩沖液濃度為400 mmol/L或500 mmol/L，pH 為6.25，為整個分離過程在10 min內基本完成，此方法完全可用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)有機酸過程中的在線監(jiān)測。

4）本論文僅對乳酸的產(chǎn)生進行了監(jiān)測，今后可以對該菌產(chǎn)生的其它有機酸的代謝進行監(jiān)測，用代謝組學的方法來研究該菌的代謝途徑，代謝通量等，從而提高其產(chǎn)乳酸的能力。

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