張輝，張文會(huì)，孫中強(qiáng)

（聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城252059）

纖維素酶是降解纖維素β-1，4 糖苷鍵，使纖維素轉(zhuǎn)變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱(chēng)。該酶系由內(nèi)切葡聚糖酶（1，4-β-D-glucan glucanohydrolase 或endo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4），外切葡聚糖纖維二糖水解酶（1，4-β-D-glucancellobilhydrolase 或exo-1，4-β-D-glucannase，EC3.2.1.91）和β-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosidase，EC3.2.1.21）三種主要成分組成[1]。纖維素酶的應(yīng)用極其廣泛，如能源、飼料、食品、紡織、造紙等諸多方面[2]。目前纖維素酶產(chǎn)生菌多為絲狀真菌，主要包括木霉屬（Trichoderma），曲霉屬（Aspergillus），青霉屬（Penicillium）和鐮刀菌屬（Fusarium）。其中，應(yīng)用最廣的以木霉屬（Trichoderma）居多[3]。雖然該類(lèi)菌能產(chǎn)生高活性的內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，但β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量較低。因此，在纖維素被水解的過(guò)程中，由于β-葡萄糖苷酶的量不足造成纖維二糖過(guò)量積累，進(jìn)而對(duì)酶的催化形成反饋抑制，造成纖維素水解效率不高[4]。因此，提高纖維素酶系中β-葡萄糖苷酶的活力是提高纖維素酶的水解效率和葡萄糖得率的重要途徑。黑曲霉是公認(rèn)的安全菌株，也是產(chǎn)纖維素酶尤其是β-葡萄糖苷酶的高產(chǎn)菌株之一。

響應(yīng)面法（Response surface methodology，RSM）是利用統(tǒng)計(jì)學(xué)技術(shù)，通過(guò)綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析數(shù)據(jù)，建立多元二次回歸方程，可快速有效地對(duì)影響產(chǎn)量的各因素水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)[5-7]，已被廣泛應(yīng)用于各種生化反應(yīng)、發(fā)酵條件優(yōu)化以及模型的建立。

目前，國(guó)內(nèi)外雖有關(guān)于優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵條件的報(bào)道，但主要側(cè)重于液體發(fā)酵，優(yōu)化方法多為單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，而對(duì)固體發(fā)酵條件的優(yōu)化，尤其是利用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化的研究相對(duì)較少。因此，本工作以一株黑曲霉（Aspergillus niger）HQ-1 為出發(fā)菌株，利用響應(yīng)面法對(duì)其產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的固體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并與相關(guān)研究進(jìn)行了比較，旨在為高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

黑曲霉（Aspergillus niger）HQ-1，由本微生物實(shí)驗(yàn)室從腐爛的廢紙中分離并保藏。

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）；種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖15.0、酵母膏4.0、K2HPO42.0、MgSO4·7H2O 1.0、起始pH6.0；固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基（500 mL 搖瓶盛放）：麥麩10.0 g、（NH4）2SO41.2 g、KH2PO41.2 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、含水量60%、起始pH7.0。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

取用PDA 斜面在28 ℃下培養(yǎng)7 d 后菌株，將滅菌的體積分?jǐn)?shù)為0.02%Tween80 溶液加入斜面，制取濃度為5×106個(gè)/mL 的孢子液。取2.5mL 孢子液接入50mL種子培養(yǎng)基（用250 mL 搖瓶盛放），28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)24 h 后得種子液，再將種子液以10%接種量接入固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基（500 mL 搖瓶盛放），28 ℃培養(yǎng)96 h。

1.2.2 粗酶液的制備

稱(chēng)取5.0 g 發(fā)酵培養(yǎng)物，加入100 mL 醋酸緩沖液（50 mmol/L，pH6.0），180 r/min 振蕩1 h 后過(guò)濾，取10 mL 濾液在10 000 r/min 下離心15min 后，取上清液即為粗酶液。

1.2.3 酶比活力測(cè)定

在試管中加入0.8 mL 的2 mmol/L 對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液（pNPG），然后加入1.0 mL 醋酸緩沖液（50 mmol/L，pH5.0），再加入0.2 mL 粗酶液后，在50 ℃水浴中反應(yīng)10 min，再加入5.0 mL 的1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，于405 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以不加底物而加等量蒸餾水為對(duì)照。

酶活力單位定義：1 秒鐘水解對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）生成1 mol 對(duì)硝基苯酚所需的酶量為1 個(gè)活力單位（kat）。酶比活力用1 g 干重的發(fā)酵培養(yǎng)物所含的酶活力單位（μkat/g）表示。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 碳源和氮源的種類(lèi)及含量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

分別用麥稈粉、玉米秸稈粉、麥麩、不同比例的玉米秸稈粉/麥麩以及麥稈粉/麥麩為碳源，確定產(chǎn)酶的最適碳源后，分別添加不同量碳源，進(jìn)一步確定碳源的最適含量。分別用（NH4）2SO4，NH4Cl，KNO3，尿素，酵母膏，蛋白胨為氮源，確定最適氮源后，再設(shè)定不同的氮源加入量培養(yǎng)并測(cè)定酶比活力，確定最適氮源含量。

1.3.2 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)（Plackett-Burman design，PBD）

選 取 玉 米 秸 稈 粉，麥 麩，（NH4）2SO4，KH2PO4，MgSO4·7H2O，含水量，培養(yǎng)溫度和起始pH 進(jìn)行考察，選擇高低兩個(gè)水平，通過(guò)Minitab14 軟件選用Factors=8，Runs=12 的Plackett-Burman 設(shè)計(jì)，以β-葡萄糖苷酶比活力作為響應(yīng)值（設(shè)為Y）。通過(guò)比較各因素的顯著性水平，篩選出對(duì)β-葡萄糖苷酶比活力影響較為顯著的因素。

1.3.3 最陡爬坡試驗(yàn)

響應(yīng)面擬合方程只有在考察的緊接鄰域中才充分近似真實(shí)情形，要先逼近最大響應(yīng)區(qū)域后，才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程[8]。最陡爬坡試驗(yàn)以響應(yīng)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各顯著因素效應(yīng)值的大小確定變化步長(zhǎng)，能快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.3.4 Box-Behnken 設(shè)計(jì)（Box-Behnken design，BBD）

用Box-Behnken 設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合響應(yīng)面模型，得到二次多項(xiàng)式，并最終確定最佳發(fā)酵條件。二次多項(xiàng)式為描述響應(yīng)量（應(yīng)變量）和自變量關(guān)系的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?duì)于3 因子系統(tǒng)，模型可描述為：

式中：Y 為預(yù)測(cè)響應(yīng)值，X1、X2和X3為獨(dú)立變量編碼值；β0為截距，β1、β2和β3為線(xiàn)性系數(shù)；β11、β22和β33為平方系數(shù)；β12、β13和β23為交互作用系數(shù)。采用Minitab14軟件和SASV8 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)和模型進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源和氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

不同碳源和最適碳源的加入量對(duì)該菌產(chǎn)酶的影響分別見(jiàn)圖1a 和圖1b，結(jié)果表明，最適碳源為玉米秸稈粉/麥麩（1/1）。以玉米秸稈粉/麥麩（1/1）為碳源，最適添加量為12.0 g。玉米秸稈粉富含纖維素，是良好的誘導(dǎo)物和碳源。麥麩作為一種農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物，不僅含有纖維素，而且還含有淀粉、蛋白質(zhì)及多種礦物質(zhì)，可為菌株提供充足的營(yíng)養(yǎng)成分[9]。不同氮源及最適氮源的加入量對(duì)產(chǎn)酶的影響見(jiàn)圖2，結(jié)果表明，以12.0 g 的玉米秸稈粉/麥麩（1/1）作為碳源時(shí)，（NH4）2SO4為產(chǎn)酶的最適氮源，其最適含量為1.5 g。這是由于無(wú)機(jī)氮源中NH4+能被菌株直接利用，從而有利于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。

2.2 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)

選用Factors=8，Runs=12 的Plackett-Burman 設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1，各因素代碼、水平及回歸分析見(jiàn)表2。

表1 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Design and results of Plackett-Burman Design

回歸分析采用置信度為95%，P＜0.05 時(shí)表示影響顯著，P＜0.01 時(shí)表示影響極為顯著。各因素回歸分析結(jié)果（表2）表明，含水量（P=0.003）、培養(yǎng)溫度（P=0.014）和起始pH（P=0.026）對(duì)酶比活力的影響較顯著，可作為主要影響因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)。由于其他因素的效應(yīng)均為正效應(yīng)，并根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖1b，圖2b），在以后的試驗(yàn)中，玉米秸稈粉、麥麩、（NH4）2SO4，KH2PO4和MgSO4·7H2O 的加入量分別取6.0 g，6.0 g，1.5 g，1.6 g 和0.8 g。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

含水量和培養(yǎng)溫度呈顯著正效應(yīng)，應(yīng)增加；起始pH 呈顯著負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減小。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及各組酶比活力見(jiàn)表3，結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶比活力在第3 組達(dá)到最大值（8.095 μkat/g），因此，以第3 組作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表2 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)中因素代碼/水平以及分析Table 2 Codes and levels of factors in Plackett-Burman design and estimate effects of factors on β-glucosidase specific activity

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of the method of steepest ascent

2.4 Box-Behnken 設(shè)計(jì)及分析結(jié)果

以β-葡萄糖苷酶比活力為響應(yīng)值（設(shè)為Y），采用Factors=3，Runs=15 的Box-Behnken 設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。各因素編碼、水平及結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 Box-Behnken 設(shè)計(jì)的因素編碼、水平及結(jié)果Table 4 Codes and levels of factors and results of Box-Behnken design

通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)式方程：

通過(guò)Minitab14 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)和模型進(jìn)行分析，采用置信度為95%、α=0.05，結(jié)果見(jiàn)表5。

可以看出，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)對(duì)酶比活力影響顯著，交互作用影響不顯著?；貧w模型極為顯著（P=0.000），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.107），說(shuō)明模型與試驗(yàn)擬合良好。方程的決定系數(shù)R2為98.7%，表明僅有1.3%的差異不能被該方程解釋。校正后的R2（Adj-R2）為96.4%，進(jìn)一步說(shuō)明該模型擬合程度良好。

依據(jù)回歸方程，利用SASV8 軟件繪出等高線(xiàn)圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。通過(guò)SASV8 軟件對(duì)方程式進(jìn)行求導(dǎo)，得到含水量為73.4%（x1=-0.15849），培養(yǎng)溫度為33.7 ℃（x2=-0.25931）和起始pH3.91（x3=-0.18811）時(shí)，β-葡萄糖苷酶比活力（Y）預(yù)測(cè)最大值為8.260 μkat/g。

表5 二次多項(xiàng)式模型的方差分析結(jié)果Table 5 Analysis of variance(ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model

2.5 模型驗(yàn)證

單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman 設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken 設(shè)計(jì)的結(jié)果表明，優(yōu)化后的發(fā)酵條件為：玉米秸稈粉6.0 g、麥麩6.0 g、（NH4）2SO41.5 g、KH2PO41.6 g、MgSO4·7H2O 0.8 g、含水量73.4 %、起始pH3.91、培養(yǎng)溫度33.7 ℃；而未優(yōu)化的發(fā)酵條件為：麥麩10.0 g、（NH4）2SO41.2 g、KH2PO41.2 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、含水量60%、起始pH7.0、培養(yǎng)溫度28 ℃。因此，將菌株分別在未優(yōu)化和優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)并進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 未優(yōu)化和優(yōu)化后黑曲霉（A.niger）HQ-1 的產(chǎn)酶歷程Table 6 Time courses of enzyme production by A.niger HQ-1 under optimized conditions and unoptimized conditions

可以看出，培養(yǎng)96 h 后，優(yōu)化后的酶比活力最高為8.244 μkat/g，比未優(yōu)化的酶比活力最高值（1.700 μkat/g）提高了3.85 倍，并與方程預(yù)測(cè)值（8.260 μkat/g）較為接近。

3 討論

和液體發(fā)酵相比，固體發(fā)酵具有成本低、產(chǎn)物濃度高、能耗少、所產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物可直接作為酶的來(lái)源等優(yōu)點(diǎn)以及能夠克服液體發(fā)酵環(huán)境抑制微生物代謝的缺點(diǎn)。另外，本工作還采用廉價(jià)的玉米秸稈粉和麥麩作為誘導(dǎo)物和碳源，進(jìn)一步降低了產(chǎn)酶成本。

本研究以對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）為底物測(cè)定β-葡萄糖苷酶比活力，該方法是國(guó)內(nèi)外常用的一種測(cè)定方法。經(jīng)優(yōu)化后，黑曲霉（A.niger）HQ-1 所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶比活力最高為8.244 μkat/g，經(jīng)換算后，高于國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道，如Melanocarpus sp.MTCC 3922 的酶比活力為1.817 μkat/g[10]，嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）CBMAI-756 的酶比活力為1.167μkat/g[11]，嗜熱子囊菌（Thermoascusaurantiacus）IMI 216529 的酶比活力為1.693 μkat/g[12]，土曲霉（Aspergillus terreus）M11 的酶比活力為2.133 μkat/g[13]，黑曲霉（Aspergillusniger）KK2 的酶比活力為1.667μkat/g[14]和煙曲霉（Aspergillus fumigatus Fresenius）的酶比活力為7.833 μkat/g[15]。

該菌株固體發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力較強(qiáng)，因此，在以后的研究中，擬對(duì)該菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行分離純化，探討其酶學(xué)性質(zhì)，以及對(duì)該酶編碼基因進(jìn)行克隆、序列分析及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化以獲得高效表達(dá)的工程菌。

[1] 顧方媛,陳朝銀,石家驥,等.纖維素酶的研究進(jìn)展與發(fā)展趨勢(shì)[J].微生物學(xué)雜志,2008,28(1):83-87

[2] 魏艷紅,熊鷹,袁永澤,等.纖維素酶產(chǎn)生菌HS-F9 的篩選鑒定和產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2010,16(2):274-278

[3] 劉小杰,何國(guó)慶,陳啟和.康氏木霉ZJ5 纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào):工學(xué)版,2003,37(5):623-628

[4] 劉小杰,何國(guó)慶,陳啟和,等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2006,6(2):6-10

[5] Long C,Ou Y,Guo P,et al. Cellulase production by solid state fermentation using bagasse with Penicillium decumbens L-06 [J].Annals of Microbiology,2009,59(3):517-523

[6] Rocky-Salimi K,Hamidi-Esfahani Z.Evaluation of the effect of particle size,aeration rate and harvest time on the production of cellulase by Trichoderma reesei QM9414 using response surface methodology[J].Food and bioproducts processing,2010,88(1):61-66

[7] Fang H,Zhao C,Song X. Optimization of enzymatic hydrolysis of steam-exploded corn stover by two approaches:Response surface methodology or using cellulase from mixed cultures of Trichoderma reesei RUT-C30 and Aspergillus niger NL02 [J].Bioresource technology,2010,101(11):4111-4119

[8] 潘紅梅,王輝,任敏.纖維素酶液體發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面分析優(yōu)化[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2008,31(8):120-124

[9] Kalogeris E,Iniotaki F,Topakas E,et al. Performance of an intermittent agitation rotating drum type bioreactor for solid-state fermentation of wheat straw[J].Bioresource Technology,2003,86(3):207-213

[10] Jatinder K,Chadha B S,Saini H S. Optimization of medium components for production of cellulases by Melanocarpus sp. MTCC 3922 under solid-state fermentation[J].World journal of microbiology and biotechnology,2006,22(1):15-22

[11] Leite R S R,Alves-Prado H F,Cabral H,et al. Production and characteristics comparison of crude β-glucosidases produced by microorganisms Thermoascus aurantiacus e Aureobasidium pullulans in agricultural wastes[J].Enzyme and microbial technology,2008,43(6):391-395

[12] Kalogeris E,Christakopoulos P,Katapodis P,et al. Production and characterization of cellulolytic enzymes from the thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus under solid state cultivation of agricultural wastes[J].Process biochemistry,2003,38(7):1099-1104

[13] Gao J,Weng H,Zhu D,et al.Production and characterization of cellulolytic enzymes from the thermoacidophilic fungal Aspergillus terreus M11 under solid-state cultivation of corn stover[J].Bioresource technology,2008,99(16):7623-7629

[14] Kang S W, Park Y S, Lee J S, et al. Production of cellulases and hemicellulases by Aspergillus niger KK2 from lignocellulosic biomass[J].Bioresource technology,2004,91(2):153-156

[15] Soni R, Nazir A, Chadha B S. Optimization of cellulase production by a versatile Aspergillus fumigatus fresenius strain (AMA) capable of efficient deinking and enzymatic hydrolysis of Solka floc and bagasse[J].Industrial crops and products,2010,31(2):277-283