包秋華，李梅花，徐潔，張家超，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）是一種人體腸道中的重要微生物，與人體健康息息相關(guān)，當(dāng)其達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，能改善或調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，降低膽固醇水平，緩解乳糖不耐癥以及抑制腫瘤細(xì)胞的形成等，即起到健康促進(jìn)效果[1-2]。目前國(guó)內(nèi)外開(kāi)發(fā)的含有嗜酸乳桿菌的乳制品種類(lèi)繁多，且其多與嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌等多菌種混合發(fā)酵[3]。大量的研究表明，益生菌在進(jìn)入消化系統(tǒng)后，其活菌含量必須達(dá)到1×106cfu/mL 以上才能發(fā)揮其健康功效，因此要求新鮮的益生菌制品中活菌數(shù)量不得低于1×107cfu/mL 才能補(bǔ)償益生菌在通過(guò)人體胃腸道時(shí)活菌數(shù)的損失[4-6]。由此可見(jiàn)，乳酸菌數(shù)量是評(píng)價(jià)活性乳酸菌制品的重要指標(biāo)[6]。但是目前我國(guó)對(duì)活性益生菌產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)督力度不夠，特別是對(duì)多菌復(fù)合的復(fù)雜樣本中L.acidophilus 的定性、定量檢測(cè)方面缺乏科學(xué)、合理、快速的方法。傳統(tǒng)方法易受培養(yǎng)條件、菌種特性等因素影響，檢測(cè)效率有限。PCR 技術(shù)和Real-Time PCR 技術(shù)具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)，成為了微生物學(xué)領(lǐng)域檢測(cè)的重要方法[7-10]。因此建立一種準(zhǔn)確的定性、定量方法來(lái)分析評(píng)價(jià)發(fā)酵乳中是否存在L.acidophilus 及其中的有效活菌數(shù)勢(shì)在必行。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株和樣本來(lái)源

L. rhamnosus 1.2134、L. plantarum 1.2437、L. fermentum 1.188：中國(guó)普通微生物菌種保藏中心；L.acidophilus ATCC 4356、L.casei ATCC393：美國(guó)American Type Culture Collection；傳統(tǒng)發(fā)酵乳酸奶樣（25#和36#）：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室于2009年從西藏采的自然發(fā)酵乳樣品。

1.2 試劑

大腸桿菌DH5α 為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；載體pMD-18T、Taq DNA polymerase、DNase I、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量的試劑盒（SYBRRPrimeScriptTMRT-PCR Kit，DRR063A，包括：DRR037S 和DRR041A）：大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）；Trizol 試劑盒：invitrogen 公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)

在Genbank 上下載嗜酸乳桿菌不同菌株及其他乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)株的16SrDNA 序列，然后利用DNAStar 中MegAlign 進(jìn)行序列比對(duì)，尋找種內(nèi)保守區(qū)域，利用Primer 5.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并通過(guò)GenBank 中Blast 檢測(cè)引物特異性，獲得嗜酸乳桿菌的特異種引物。引物序列如下：上游引物Af 為5′-AGCTGAACCAACAGAT TCAC-3′，下游引物Ar 為5′-ACTACCAGGGTATCTA ATCC-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為759 bp。

1.4 定性分析

采用反復(fù)凍融CTAB 法[11]提取發(fā)酵乳樣品和部分乳酸桿菌（包括模式菌L.acidophilus ATCC 4356）的基因組DNA，純化后稀釋至100 ng/μL 備用。采用種特異性PCR 驗(yàn)證引物特異性，并檢測(cè)自然發(fā)酵乳樣本中是否含有L. acidophilus。反應(yīng)體系25.0 μL：2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，共2.5 μL 5 mmol/L 上下游引物（Af 和Ar），1.0 μL 100 ng/μL DNA 模板，0.25 μL 5 U/μL Taq 酶（TakaRa），用二次蒸餾水補(bǔ)足至25.0 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性40 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)40 次；72 ℃延伸8 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

1.5 L.acidophilus 的定量測(cè)定

1.5.1 L. acidophilus ATCC 4356 的16S rDNA 基因的克隆

將L.acidophilus ATCC 4356 的PCR 產(chǎn)物與pMD-18T 連接轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、PCR、酶切分析等方法檢測(cè)獲得陽(yáng)性克隆子pAT[12]。

1.5.2 外標(biāo)準(zhǔn)品的制備

提取以含有目的擴(kuò)增片斷的質(zhì)粒pAT 總DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A 值后，計(jì)算出拷貝數(shù)，做10 倍系列稀釋?zhuān)荻认♂屩?09～102拷貝數(shù)/μL 的濃度，以此作為外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。

1.5.3 樣本RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄成cDNA

按Trizol 試劑盒（invitrogen） 說(shuō)明書(shū)提取樣品RNA，然后用DNase I 處理一至兩次，確保完全消除RNA 中的DNA 污染，得到純化的RNA。反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增按TaKaRa Code DRR037S 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)條件：37 ℃反應(yīng)15 min；85 ℃變性5 s。

1.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和定量反應(yīng)系統(tǒng)特異性評(píng)定

以待測(cè)樣品cDNA 和外標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用L.acidophilus 種特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增。熒光定量PCR 反應(yīng)參數(shù)：95 ℃變性25 s；95 ℃變性10 s，56 ℃退火22 s，40 個(gè)循環(huán)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和相應(yīng)的計(jì)算機(jī)軟件實(shí)現(xiàn)發(fā)酵乳中L. acidophilus 的快速定量檢測(cè)。繪制融解曲線的范圍從70 ℃緩慢升溫至95 ℃，溫度每升高0.5 ℃讀一次熒光值，由IQ5 Real-Time PCR儀自動(dòng)繪制融解曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.acidophilus 的種屬特異性引物驗(yàn)證和定性檢測(cè)

檢測(cè)時(shí)一般認(rèn)為陽(yáng)性特征在759 bp 處出現(xiàn)預(yù)期擴(kuò)增條帶，說(shuō)明此樣本中含有L.acidophilus，陰性對(duì)照無(wú)特征條帶，見(jiàn)圖1。

圖1 中泳道1 為pAT；泳道3 為模式菌L. acidophilus ATCC 4356；泳道4、5 為從西藏采的自然發(fā)酵乳25#、36#樣本，結(jié)果為陰性，說(shuō)明這2 份樣本不含L.acidophilus。泳道6～9 為L(zhǎng).acidophilus 外的其他種乳酸菌，結(jié)果為陰性，說(shuō)明引物特異性好，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 快速定量檢測(cè)L.acidophilus 的方法的建立

以不同拷貝數(shù)的陽(yáng)性模板pAT 的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR 反應(yīng)過(guò)程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標(biāo)得到嗜酸乳桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線。待檢樣本25#、36#和外標(biāo)樣本同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2 可見(jiàn)，Ct 值和拷貝數(shù)呈較好的線性關(guān)系，以初始模板量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct 值為縱坐標(biāo)，繪制出的熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=-3.582X+38（Y代表Ct 值，X 代表初始模板量的對(duì)數(shù)），初始模板濃度與Ct 值之間線性相關(guān)系數(shù)為0.987，斜率為-3.582，所建立的L.acidophilus 標(biāo)準(zhǔn)曲線符合Real-Time PCR 定量的要求。

SYBR GreenⅠ熒光定量反應(yīng)系統(tǒng)特異性評(píng)定是通過(guò)分析PCR 產(chǎn)物的融解曲線來(lái)實(shí)現(xiàn)的，不同的PCR產(chǎn)物其融解曲線也不同，并可以排除引物二聚體等非特異性干擾，見(jiàn)圖3。

由圖3 可見(jiàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線一致，且都為單一峰型的曲線，證明熒光染料的定量反應(yīng)系統(tǒng)特異性良好，引物和PCR 反映條件都適合進(jìn)行熒光定量。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)利用乳酸菌的16S rDNA 基因序列設(shè)計(jì)L.acidophilus 種特異性引物，以含有L. acidophilus 16S rDNA 基因的pAT 質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)種特異性PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)建立了一種對(duì)多菌復(fù)合的復(fù)雜樣本中L. acidophilus 的定性、定量檢測(cè)方法，為益生菌產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和質(zhì)量監(jiān)管奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：所設(shè)計(jì)嗜酸乳桿菌引物特異性較好；定性方法可以直觀的從圖上看出待測(cè)菌是否含有嗜酸乳桿菌，與傳統(tǒng)的生理生化鑒定相比既簡(jiǎn)便又準(zhǔn)確；絕對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量方法的優(yōu)勢(shì)在于能夠?qū)?fù)雜樣本中某一種菌進(jìn)行準(zhǔn)確定量。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)RNA 易降解，最好采用核酸提取儀破碎原始樣本中的細(xì)胞，比液氮研磨法提取的RNA 損失小，準(zhǔn)確率高。

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