宋彥顯，閔玉濤

（中州大學(xué)化工食品學(xué)院，河南鄭州450044）

糖尿病是目前威脅人類(lèi)健康的主要慢性病之一，患者中約95%為Ⅱ型（非胰島素依賴型），其主要癥狀表現(xiàn)為餐后高血糖。餐后高血糖是心血管疾病患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，另外，餐后血糖越高，糖尿病微量蛋白尿和視網(wǎng)膜病變的發(fā)生率也越高。因此，控制好餐后血糖很重要。體內(nèi)淀粉等碳水化合物在α-淀粉酶催化作用下轉(zhuǎn)化為糊精和麥芽糖，后者進(jìn)一步水解為葡萄糖，經(jīng)小腸吸收進(jìn)入血液，可導(dǎo)致餐后血糖上升。

食品在防治糖尿病方面的重要性不亞于藥物，并有藥食同源的優(yōu)勢(shì)，抗性淀粉在這一領(lǐng)域中具有特殊的意義。抗性淀粉（RS）是一種新型的低熱量功能性食品基料，它不能被小腸中的淀粉酶類(lèi)水解，因而可延緩餐后血糖升高[1]。美國(guó)專(zhuān)利（US2006025381A1）宣稱它可以調(diào)節(jié)和控制餐后血糖[2]。因此其研究和實(shí)驗(yàn)方法就成為該領(lǐng)域的重要內(nèi)容，不管是各種淀粉制備優(yōu)化條件的分析跟蹤，還是不同種類(lèi)淀粉材料抗性的對(duì)比和評(píng)價(jià)都離不開(kāi)可靠的分析實(shí)驗(yàn)方法。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體實(shí)驗(yàn)之前，體外實(shí)驗(yàn)可以節(jié)省大量的人力和金錢(qián)，是篩選和發(fā)現(xiàn)各種新型抗性食品材料的重要手段。

本文采用仿生實(shí)驗(yàn)條件并與特定的糖分析方法相結(jié)合，構(gòu)建了淀粉的體外消化模型，是傳統(tǒng)經(jīng)典方法的一個(gè)很好的補(bǔ)充，并在交聯(lián)淀粉消化研究中進(jìn)行了應(yīng)用，為新型降糖因子的研究與開(kāi)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬胰α-淀粉酶，比活力2 433 nkat/mg，中州大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室自制；所用試劑均為化學(xué)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

721 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海第三分析儀器廠；ZHP-160-恒溫振蕩培養(yǎng)箱：江蘇省金壇市漢康電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉仿生消化法的建立

1.3.1.1 淀粉體外消化條件的模擬

1 %的淀粉糊，煮10 min，冷卻至35 ℃左右，取1 mL 放入透析袋中，加入0.5 mL 的α-淀粉酶，置pH6.9 的PBS 緩沖液中，置37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中透析3 h，轉(zhuǎn)速20 r/min，每30 分鐘取透析液一次，每次0.5 mL，稀釋至適當(dāng)濃度，分別置于6 支試管中，以緩沖液為空白樣，進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取5%的檢測(cè)樣品溶液0.5 mL，放入25 mL 比色管中，加苯酚液1 mL，搖勻，并迅速垂直加入5 mL 濃硫酸，再次搖勻，室溫放置30 min，分光光度計(jì)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。

1.3.1.3 苯酚及硫酸用量的選擇

取0.5 mL 檢測(cè)樣品液5 份，分別加入苯酚液0.5、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，加水至等體積，分別加入5 mL 濃硫酸，室溫放置30 min 后，在485 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值。另取樣品液0.5 mL（5 份），分別加苯酚液1.0 mL，再分別滴加濃硫酸2、3、4、5、6 mL 并加水至等體積，以上法測(cè)吸光值。

1.3.1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

在最佳的反應(yīng)條件下進(jìn)行二次掃描，確定最終檢測(cè)波長(zhǎng)[2]。

1.3.1.5 反應(yīng)溫度的選擇

取0.5 mL 同一濃度的樣品液9 份，分別加入1．2．3所確定的苯酚及硫酸用量，置室溫（25 ℃）、70 ℃、100 ℃各3 份，保溫30 min 后冷卻5 min，485 nm 測(cè)吸光度值。

1.3.1.6 反應(yīng)時(shí)間的選擇

取樣品液0.5 mL，在優(yōu)化反應(yīng)條件下反應(yīng)，每隔一定時(shí)間于485 nm 處測(cè)吸光度值，以達(dá)到吸光度值穩(wěn)定的最短時(shí)間為最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.1.7 顯色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在最佳反應(yīng)條件下每間隔一定時(shí)間檢測(cè)一次受試樣品吸光度值，考查受試樣品顯色后的穩(wěn)定性。

1.3.1.8 線性關(guān)系的考查及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將 系 列 濃 度（0.5、1、5、8、10、30、40、50、60、80、100、200、300、400、500 mg/mL）的葡萄糖溶液，各取0.5 mL，以蒸餾水為空白對(duì)照，按上述方法顯色檢測(cè)，以糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制曲線，再以直線部分做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.3.2 土豆交聯(lián)淀粉的制備

1.3.2.1 交聯(lián)淀粉的制備

取一定量土豆淀粉，溶于氫氧化鈉（淀粉干質(zhì)量的1.5%）溶液中，置于50 ℃恒溫水浴鍋中，機(jī)械攪拌加熱3 min～5 min 后，將含有一定量的環(huán)氧氯丙烷（淀粉干質(zhì)量的0.58%）的堿液滴加到淀粉乳中，中途不斷攪拌，反應(yīng)6 h。用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 至7.0，靜置30 min后，3 000 r/min 離心10 min，共4 次，去除上清液，將底部沉積物轉(zhuǎn)移到搪瓷盤(pán)中，置干燥箱中55 ℃干燥，研磨，即為交聯(lián)淀粉。

1.3.2.2 沉降積的測(cè)定

稱取0.500 g 交聯(lián)淀粉，放入100 mL 的燒杯中，加蒸餾水稀釋至2%，將燒杯置于82 ℃～85 ℃水浴加熱，稍加攪拌，保溫2 min，取出冷卻至室溫。取10 mL 糊液置于帶刻度的離心管中，4 000 r/min 離心2 min，將上清液轉(zhuǎn)入10 mL 量筒中，讀值，計(jì)算沉降體積。沉降積計(jì)算公式為：S=10-V，式中：S 為沉降積，mL；V 為上清液體積，mL。

1.3.3 土豆交聯(lián)淀粉體外消化性能研究

參照1.3.1 構(gòu)建的消化模型，進(jìn)行土豆交聯(lián)淀粉體外消化性能研究。

2 結(jié)果與討論

2.1 淀粉體外消化條件的優(yōu)化

2．1.1 淀粉體外消化條件的模擬

在體外模擬體內(nèi)的消化條件，以透析袋模擬腸道，以恒溫振蕩培養(yǎng)箱保持37 ℃恒溫模擬體溫，以pH6.9 緩沖液模擬消化道的pH，以20 r/min 的轉(zhuǎn)速振蕩代替腸的蠕動(dòng)，而透析袋透析出來(lái)的分子量切割10 000 以下的物質(zhì)相當(dāng)于寡糖、單糖，分別是消化過(guò)程中第一步和第二步的產(chǎn)物，采用硫酸-苯酚法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定即可得知淀粉的消化情況。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

樣品掃描色譜，見(jiàn)圖1。

由圖1 可看出在485 nm 處有最大吸收峰。

2．1.3 苯酚及硫酸用量選擇

采用硫酸-苯酚法測(cè)出的寡糖和單糖的總和。菲林法和DNS 法測(cè)定的是可溶性還原糖，見(jiàn)表1、表2。

表1 苯酚用量選擇Table 1 Phenol dosage selection table

表2 硫酸用量選擇Table 2 Sulfate dosage selection table

由表1、2 可知，苯酚及硫酸用量分別選擇0.6 mL，4 mL 為宜。

2．1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

苯酚及硫酸用量選擇后的色譜，見(jiàn)圖2。

與圖1 相比，發(fā)現(xiàn)最大吸收波長(zhǎng)并沒(méi)改變，仍為485 nm，所以最終確認(rèn)檢測(cè)波長(zhǎng)為485 nm，由于在最大波長(zhǎng)處信噪比最大，靈敏度最高，所以選擇檢測(cè)波長(zhǎng)在最大吸收波長(zhǎng)。

2．1.5 反應(yīng)溫度及時(shí)間的選擇

不同反應(yīng)溫度下的吸光度，見(jiàn)表3；不同反應(yīng)時(shí)間下的吸光度，見(jiàn)表4。

表3 不同反應(yīng)溫度下的吸光度Table 3 The absorbance values at different reaction temperatures

表4 不同反應(yīng)時(shí)間下的吸光度Table 4 The absorbance values of different time

由表3 可知，100 ℃下吸光度值最大，由表4 可知，反應(yīng)30 min 后吸光度值基本穩(wěn)定，因此反應(yīng)溫度選擇100 ℃，反應(yīng)時(shí)間定為30 min。

2．1.6 顯色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

不同時(shí)間的吸光度值，見(jiàn)表5。

表5 不同時(shí)間的吸光度值Table 5 The absorbance values of the different time

由表5 可知，2 h 內(nèi)顯色基本穩(wěn)定。

2．1.7 線性關(guān)系的考查及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

線性關(guān)系的考查及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，見(jiàn)圖3、圖4。

由圖3 圖4 可看出糖濃度在0～80 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程為y = 0.004 4x - 0.005，R2=0.998 8。

2.2 交聯(lián)淀粉沉降積的測(cè)定

對(duì)土豆交聯(lián)淀粉的沉降積進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 交聯(lián)淀粉沉降積測(cè)定結(jié)果Table 6 Crosslinked starch settlement plot measurement results

從表6 結(jié)果可知交聯(lián)淀粉沉降積由小到大依次為5、3、7、8、6、1、4、9、2.沉降積越小，交聯(lián)度越高，由此可知，5 號(hào)交聯(lián)淀粉的交聯(lián)度最高，其次是3、7 號(hào)。

2.3 淀粉消化性能的測(cè)定

根據(jù)線性回歸方程y=0.004 4x-0.005，R2=0.998 8計(jì)算得結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 表明，土豆交聯(lián)淀粉顆粒消化性能的變化趨勢(shì)與原淀粉糊基本相同，隨著消化時(shí)間的不斷增加，消化產(chǎn)物量不斷增大，平均消化速度不斷減小，但其數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于原淀粉糊的數(shù)值。在體外模型系統(tǒng)（In-Vitro）中測(cè)定它們?cè)诓煌瘯r(shí)間的消化產(chǎn)物，結(jié)果如圖1 和圖表5 所示。隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，土豆淀粉及微細(xì)化樣品的消化產(chǎn)物不斷增加，平均消化速度則不斷減慢。這是因?yàn)棣?淀粉酶是內(nèi)切酶，能無(wú)規(guī)則地水解淀粉分子中的α-1，4 葡萄糖甙鍵。在水解初期，淀粉糊中龐大的結(jié)構(gòu)松散的分子很容易被切斷成較小的分子，水解速度較快[3]。但隨著淀粉鏈變短，酶作用底物的結(jié)合點(diǎn)也相應(yīng)減少，且α-淀粉酶不能水解淀粉的α-1，6 葡萄糖甙鍵，使水解速度迅速減慢[4]。

采用In-Vitro 系統(tǒng)測(cè)定它們及原淀粉顆粒的消化速度，結(jié)果如表5 與圖1 所示。結(jié)果表明高交聯(lián)度的土豆淀粉的消化速度要明顯慢于低交聯(lián)度及原土豆淀粉。隨交聯(lián)度的增大，消化速度不斷降低。

影響In-Vitro 消化系統(tǒng)中淀粉顆粒消化速度的因素主要來(lái)自兩方面：一是唾液α-淀粉酶與淀粉顆粒的酶促反應(yīng)速度；另一原因是消化產(chǎn)物在滲析袋中的擴(kuò)散和滲析速度。唾液α-淀粉酶與淀粉顆粒作用為固液兩相反應(yīng)，酶分子首先由液相擴(kuò)散到淀粉顆粒表面，使酶活性中心與淀粉分子鏈的特定區(qū)域結(jié)合并定位；然后酶分子的催化部位再進(jìn)行催化淀粉水解的作用。顯然，由于變性處理而導(dǎo)致的淀粉分子結(jié)構(gòu)和組成的變化會(huì)不可避免地影響酶促反應(yīng)各步的進(jìn)行，從而影響淀粉顆粒對(duì)淀粉酶作用的敏感性。當(dāng)較低交聯(lián)度時(shí)，交聯(lián)鍵的分布極其稀疏即交聯(lián)密度很小[5]。唾液α-淀粉酶是分子內(nèi)切酶，它以無(wú)規(guī)則的方式深入淀粉分子鏈的內(nèi)部對(duì)淀粉分子進(jìn)行水解，所以較低交聯(lián)度并不會(huì)阻礙唾液α-淀粉酶對(duì)淀粉分子的攻擊。隨著交聯(lián)度的增加，交聯(lián)的空間位阻逐漸體現(xiàn)出來(lái)，因而消化速度逐漸降低。此外這些淀粉樣品的消化速度均隨消化時(shí)間延長(zhǎng)而降低，是因?yàn)榭膳c唾液α-淀粉酶作用的合適分子鏈大小的淀粉分子不斷減少的緣故。

3 結(jié)論

1）以恒溫箱振蕩培養(yǎng)箱保持37 ℃恒溫，以pH6.9緩沖液維持恒定的pH，以20 r/min 的轉(zhuǎn)速振蕩模擬腸胃的蠕動(dòng)，以透析袋模擬腸胃，在體外模擬體內(nèi)的消化條件，建立In-Vitro 仿生消化法。

2）消化性能最佳測(cè)定條件：波長(zhǎng)485 nm，顯色溫度100 ℃，顯色時(shí)間30 min，且其樣品液在2 h 內(nèi)顯色穩(wěn)定。

3）以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)品，糖濃度在0～80μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程為y=0.004 4x-0.005，R2=0.998 8。

4）原土豆淀粉經(jīng)交聯(lián)后其消化性降低13.7 %～34.5%，且交聯(lián)度與消化性呈負(fù)相關(guān)性，即交聯(lián)度越高（沉降積越?。阅茉降?。

[1] 許安邦.食品分析[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1994:371-372

[2] 郭勇,鄭穗平.酶學(xué)[M].上海:華南理工大學(xué)出版社,2000:84-90

[3] 張力田．變性淀粉[M]．廣州:華南理工大學(xué)出版社,1991:138

[4] 張鐘,華平,王立權(quán)．羧甲基淀粉作酸奶穩(wěn)定劑的應(yīng)用效果研究[J]．飲料工業(yè),2004(4):391

[5] 王顯倫,文向前,張文.淀粉及變性淀粉對(duì)面條品質(zhì)影響研究[J].鄭州糧食學(xué)院學(xué)報(bào),2000(9):44-46