李雙石，李浡，吳志明，王曉杰，蘇寧

（1.北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京100029；2.中糧華夏長(zhǎng)城葡萄酒有限公司，河北昌黎066600）

葡萄酒釀造是一個(gè)復(fù)雜的微生物學(xué)過(guò)程，其中酵母菌是葡萄酒發(fā)酵工業(yè)中占主導(dǎo)地位的微生物。葡萄酒的釀造就是在酵母菌的作用下，采用自然發(fā)酵或者純種發(fā)酵，將葡萄原料中各種潛在質(zhì)量在酒中充分表現(xiàn)出來(lái)。在酒精發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌在將糖轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳的同時(shí)，還產(chǎn)生很多副產(chǎn)物，它們直接影響到葡萄酒的口感和風(fēng)味，決定了酒品質(zhì)的優(yōu)劣[1]。葡萄酒香氣是衡量葡萄酒質(zhì)量的重要指標(biāo)，它們對(duì)葡萄酒的產(chǎn)地風(fēng)格和典型性均起決定性的作用。葡萄酒的香氣物質(zhì)根據(jù)來(lái)源分類(lèi)，可分為三大類(lèi)，即葡萄漿果香氣、發(fā)酵香氣和陳釀香氣，葡萄酒總體芳香成分的大部分是由發(fā)酵香氣組成的[2]。前期研究表明，葡萄酒中含有多種香氣物質(zhì)，目前已經(jīng)報(bào)道的有1 300 多種，主要包括醇類(lèi)、酯類(lèi)、酸類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、萜烯類(lèi)等，其中，超過(guò)400 種的成分是由酵母發(fā)酵產(chǎn)生的[3]。

國(guó)內(nèi)對(duì)葡萄酒中香氣成分研究報(bào)道較多，但關(guān)于酵母對(duì)葡萄酒香氣的影響報(bào)道較少。本研究采用自然發(fā)酵、本土優(yōu)選釀酒酵母菌株Y14 接種發(fā)酵、國(guó)外商業(yè)葡萄酒活性干酵母F15 接種發(fā)酵分別進(jìn)行葡萄酒釀造實(shí)驗(yàn)，并利用頂空固相微萃?。℉S-SPME）和氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析葡萄酒中的香氣成分，研究不同酵母對(duì)葡萄酒中揮發(fā)性香氣成分的影響，旨在為釀酒工藝實(shí)施提供理論參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：本土釀酒酵母菌株Y14 分離自釀酒葡萄的自然發(fā)酵液；對(duì)照釀酒酵母F15 是進(jìn)口葡萄酒商業(yè)活性干酵母Zymaflora F15：法國(guó)拉曼公司。

供試葡萄原料：2011年10月市售成熟的巨峰葡萄（Kyoho）。

主要儀器設(shè)備：Agilent6890A 氣相色譜儀和Agilent 5975B 質(zhì)譜儀聯(lián)用（購(gòu)自美國(guó)Agilent 公司）；固相微萃取裝置和PDMS/CAR/DVB 固相微萃取頭（50/30 μm）（購(gòu)自美國(guó)Supelco 公司）。

1.2 方法

1.2.1 葡萄酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

用2～4 層經(jīng)滅菌的紗布將新鮮、成熟的葡萄原料包起來(lái)，在無(wú)菌條件下用手?jǐn)D壓，將300 mL 葡萄汁置于無(wú)菌三角瓶中，并將殘余的葡萄皮及葡萄籽也加入瓶?jī)?nèi)。在葡萄汁中加入亞硫酸至SO2有效含量達(dá)到60 mg/L，混合均勻，用封口膜密封。然后依不同的處理方法不接種酵母或接種活化好的酵母，25 ℃靜置發(fā)酵，每日分3 次稱(chēng)量發(fā)酵液重量，至發(fā)酵液重量不變時(shí)即為發(fā)酵終止。酒精發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)葡萄酒樣進(jìn)行取樣，低溫保存，待進(jìn)一步成分分析。

3 種不同的酵母接種處理有：不接種純種酵母，即自然發(fā)酵；本土優(yōu)選釀酒酵母菌株Y14 活化后，依3%接種量接種；進(jìn)口商業(yè)活性干酵母F15 依產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)活化接種。

1.2.2 葡萄酒樣香氣成分提取

頂空固相微萃取方法：將不同處理的葡萄酒樣用0.45 μm 膜過(guò)濾，吸取5 mL 待測(cè)葡萄酒樣品加入至15 mL 的頂空微萃取樣品瓶中，同時(shí)放入1 g NaCl 和磁力轉(zhuǎn)子，迅速用樣品蓋擰緊后置于恒溫磁力攪拌加熱平臺(tái)上。將已活化的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，萃取頭距離液面1 cm。于40 ℃下吸附30 min，吸附后的萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口，于250 ℃熱解析8 min。

1.2.3 葡萄酒樣香氣成分分析

GC-MS 分析：DB-FFAP 毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）；載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min；手動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，采用不分流模式；柱溫箱升溫程序?yàn)椋?0 ℃保持5 min，再以10 ℃/min 的速度升溫至240 ℃，保持2 min。質(zhì)譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離方式EI，離子能量70 ev，質(zhì)量掃描范圍為20 u～350 u。

香氣物質(zhì)定性定量分析：利用質(zhì)譜全離子掃描圖譜，依據(jù)已有標(biāo)樣的色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜信息、NIST05 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)比對(duì)結(jié)果對(duì)葡萄酒中的香氣物質(zhì)進(jìn)行定性分析。采用氣相色譜峰面積歸一化法確定各香氣組分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同酵母發(fā)酵葡萄酒樣香氣成分分析

不同酵母發(fā)酵的葡萄酒樣中共檢測(cè)出揮發(fā)性香氣成分81 種，表1 列出了60 種主要成分，其中含醇類(lèi)30 種、酯類(lèi)20 種、酸類(lèi)10 種。

葡萄酒自然發(fā)酵就是利用葡萄果皮表面或空氣中的天然野生酵母進(jìn)行發(fā)酵的過(guò)程。自然發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的酵母菌群消長(zhǎng)和更替的過(guò)程，有大量的酵母菌種參與。由表1 可見(jiàn)，自然發(fā)酵的葡萄酒樣中香氣成分最復(fù)雜，共檢測(cè)出53 種香氣成分，由此可見(jiàn)多種酵母菌種的參與有助于增加葡萄酒中香氣物質(zhì)組成的復(fù)雜性。自然發(fā)酵酒樣中主要的香氣成分有異戊醇（33.11%）、苯乙醇（8.63%）、三甲基硅醇（2.52%）、三氟乙酸基油醇（2.46%）、異丁醇（2.45%）、棕櫚酸乙酯（2.30%）和辛酸（2.25%）。

目前葡萄酒工業(yè)生產(chǎn)中大量使用商用葡萄酒活性干酵母，優(yōu)良的葡萄酒活性干酵母能使性能優(yōu)良的釀酒酵母在整個(gè)葡萄酒釀造過(guò)程中占優(yōu)勢(shì)，能確保葡萄酒發(fā)酵過(guò)程的穩(wěn)定和葡萄酒質(zhì)量的穩(wěn)定。本研究采用國(guó)外商業(yè)活性干酵母F15 接種發(fā)酵，此葡萄酒樣中共檢測(cè)出47 種香氣成分，主要的香氣成分為乙酸乙酯（19.91%）、異戊醇（14.44%）、醋酸（12.75%）、苯乙醇（10.47%）和異丁醇（2.90%）。

表1 不同釀酒酵母菌株發(fā)酵葡萄酒中香氣物質(zhì)的含量Table 1 Volatile aroma components of wines fermented by different yeast strains

續(xù)表1 不同釀酒酵母菌株發(fā)酵葡萄酒中香氣物質(zhì)的含量Continue table 1 Volatile aroma components of wines fermented by different yeast strains

由于國(guó)內(nèi)的葡萄酒廠主要靠引入國(guó)外活性干酵母進(jìn)行葡萄酒生產(chǎn)，葡萄酒產(chǎn)品出現(xiàn)了同質(zhì)化的缺陷，因此，性能優(yōu)良本土葡萄酒酵母菌株的開(kāi)發(fā)和利用成為當(dāng)今葡萄酒研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[4]。本研究采用的本土優(yōu)篩酵母Y14 發(fā)酵的葡萄酒樣中共檢測(cè)出39 種香氣成分，主要的香氣成分為異戊醇（20.97%）、乙酸乙酯（13.10%）、苯乙醇（11.66%）、醋酸（9.46%）、三甲基硅醇（3.71%）、乙酸苯乙酯（2.28%）和異丁醇（2.20%）。

2.2 不同酵母發(fā)酵葡萄酒樣香氣成分比較

2.2.1 醇類(lèi)組分比較

葡萄酒中的醇類(lèi)物質(zhì)是構(gòu)成葡萄酒發(fā)酵香氣的主要物質(zhì)，它們主要是酵母酒精發(fā)酵過(guò)程中氨基酸或糖代謝的產(chǎn)物。適量的醇能給葡萄酒帶來(lái)良好香氣，它們可使葡萄酒的香氣更為復(fù)雜、濃郁；但多數(shù)醇類(lèi)具有不愉快的香氣，可能對(duì)葡萄酒的香氣質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)向貢獻(xiàn)[2，5]。由表1 可以看出，醇類(lèi)物質(zhì)是所有發(fā)酵酒樣香氣組成的主體成分。所有葡萄酒樣中共檢測(cè)出30種醇類(lèi)物質(zhì)，但共有成分僅有6 種。

在不同酒樣中含量最高的醇類(lèi)物質(zhì)均為異戊醇，其中自然發(fā)酵酒樣中此組分含量最高為33.11%，其次是本土菌株Y14 發(fā)酵酒樣為20.97%，F(xiàn)15 發(fā)酵酒樣中此組分含量最低，僅為14.44%。異戊醇則具有青草或香蕉的香氣，可使葡萄酒具有白蘭地的香型。在不同酒樣中含量位居第二的醇類(lèi)物質(zhì)都是苯乙醇，此組分在單一菌種發(fā)酵酒樣中含量較高，分別為11.66%（Y14）和10.47%（F15），而在自然發(fā)酵酒樣中含量?jī)H為8.63%，由此可見(jiàn)，此物質(zhì)可能主要是釀酒酵母的代謝產(chǎn)物。苯乙醇可賦予葡萄酒愉快的玫瑰香、紫蘿蘭香、茉莉花香等多種風(fēng)味。在不同酒樣中含量較高的醇類(lèi)物質(zhì)還有三甲基硅醇、異丁醇和正己醇。在自然發(fā)酵和本土優(yōu)選釀酒酵母Y14 的發(fā)酵酒樣中，三甲基硅醇的含量?jī)H次于異戊醇和苯乙醇，分別占全部香氣成分的2.52%和3.71%，而在商業(yè)酵母F15 發(fā)酵酒樣中的含量?jī)H為1.67%，可見(jiàn)此物質(zhì)可能是本地酵母發(fā)酵的特征性香氣成分。國(guó)外商業(yè)酵母F15 發(fā)酵酒樣中含量位居第三的醇類(lèi)物質(zhì)則為異丁醇，它占全部香氣成分的2.90%。

從醇類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)區(qū)別來(lái)看，商業(yè)活性干酵母F15 接種發(fā)酵的葡萄酒樣中含有最多種類(lèi)的醇類(lèi)物質(zhì)，高達(dá)17 種，其中特有香氣成分有10 種；自然發(fā)酵酒樣和本土釀酒酵母Y14 接種發(fā)酵的酒樣中均含有醇類(lèi)物質(zhì)13 種，其中分別含有特有香氣成分6 種和7種。從醇類(lèi)物質(zhì)的含量區(qū)別來(lái)看，自然發(fā)酵酒樣中醇類(lèi)物質(zhì)的含量最高，高達(dá)53.43%；其次是Y14 接種發(fā)酵酒樣，占41.45%；F15 接種發(fā)酵酒樣中醇類(lèi)物質(zhì)含量最低，只占34.75%。

2.2.2 酯類(lèi)組分比較

大多數(shù)酯類(lèi)物質(zhì)具有鮮花或水果的香氣，有益于葡萄酒的香氣質(zhì)量。影響葡萄酒中酯類(lèi)組成和含量的主要因素是葡萄汁的化學(xué)組成和所采用的釀造工藝，當(dāng)以上因素確定時(shí)，所選用的酵母菌株對(duì)葡萄酒中酯類(lèi)組成影響就顯得至關(guān)重要了[6]。本研究中，不同酵母發(fā)酵的葡萄酒樣中共檢測(cè)出酯類(lèi)物質(zhì)20 種，但共有的酯類(lèi)組分僅有3 種，它們是乙酸乙酯、乙酸異戊酯和棕櫚酸乙酯。

在F15 和Y14 接種發(fā)酵酒樣中含量最高的酯類(lèi)成分是乙酸乙酯，此成分含量分別占香氣總含量的19.91%和13.10%，乙酸乙酯具有果香和奶油味，而在自然發(fā)酵酒樣中此組分的含量?jī)H為1.83%。在自然發(fā)酵酒樣中含量最高的酯類(lèi)成分是棕櫚酸乙酯（2.30%），此物質(zhì)具有蘋(píng)果和菠蘿香氣。乙酸異戊酯在自然發(fā)酵酒樣中含量較高（1.13%），而在單一菌種接種發(fā)酵酒樣中的含量均較低，分別為0.42 %（F15）和0.26 %（Y14），乙酸異戊酯具有較強(qiáng)的新鮮果香，可賦予葡萄酒香蕉、梨、蘋(píng)果的酸甜味。有兩種酯類(lèi)組分（乙酸苯乙酯、辛乙烯二醇正十二烷基酯）僅存在于本地酵母發(fā)酵的葡萄酒樣中，它們可能是本土酵母發(fā)酵生成的特征性香氣成分，其中乙酸苯乙酯在Y14 接種發(fā)酵的酒樣中含量高達(dá)2.28%，乙酸苯乙酯可賦予葡萄酒花香。乳酸乙酯僅存在于兩種單一菌種接種發(fā)酵酒樣中，乳酸乙酯具有水果和奶油香氣，可見(jiàn)此物質(zhì)可能主要是釀酒酵母的代謝產(chǎn)物。

從酯類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)差異來(lái)看，自然發(fā)酵酒樣中含有最多種類(lèi)的酯類(lèi)物質(zhì)，高達(dá)14 種，而在F15 和Y14接種發(fā)酵的酒樣中分別只含有酯類(lèi)物質(zhì)8 種和7 種。不同發(fā)酵酒樣中所含酯類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)區(qū)別較大，自然發(fā)酵酒樣中獨(dú)有的香氣成分有9 種，F(xiàn)15 接種發(fā)酵酒樣中獨(dú)有的香氣成分有4 種，Y14 接種發(fā)酵酒樣中獨(dú)有的香氣成分有1 種。從酯類(lèi)物質(zhì)的含量差異來(lái)看，F(xiàn)15接種發(fā)酵酒樣中醇類(lèi)含量最高，占全部香氣成分的24.88%；其次是Y14 接種發(fā)酵酒樣，占19.40%；在自然發(fā)酵酒樣中醇類(lèi)物質(zhì)含量只占12.33%。

2.2.3 酸類(lèi)

有機(jī)酸是保持果酒中酒體平衡和口感清爽特性的主要物質(zhì)，如適宜的含酸量能使葡萄酒帶有新鮮的水果香，能修飾葡萄酒的滋味和口感，并且有利于形成瓶貯酒香[7]。酸類(lèi)物質(zhì)的組成和含量同樣受到所選用酵母菌株的影響[8]。

由表1 可知，不同酵母發(fā)酵的葡萄酒樣中共檢測(cè)出10 種酸類(lèi)物質(zhì)，但共有酸類(lèi)組分僅有2 種，為醋酸和辛酸。F15 和Y14 接種發(fā)酵酒樣中酸類(lèi)物質(zhì)的含量較高，分別占全部香氣成分的14.90%和12.99%，且含量最高的酸類(lèi)物質(zhì)均為醋酸。自然發(fā)酵酒樣中酸類(lèi)物質(zhì)含量較低，僅占全部香氣成分的5.01%，且以辛酸為主。

從酸類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)差異來(lái)看，自然發(fā)酵、F15 接種發(fā)酵和Y14 接種發(fā)酵的酒樣中分別含有酸類(lèi)物質(zhì)6種、7 種和5 種，但種類(lèi)區(qū)別較大，自然發(fā)酵酒樣中獨(dú)有的香氣成分有2 種，F(xiàn)15 和Y14 接種發(fā)酵酒樣中獨(dú)有的香氣成分均只有1 種。

3 結(jié)論

采用頂空固相微萃取（HS-SPME）和氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析不同酵母發(fā)酵葡萄酒中的香氣成分，結(jié)果表明，不同的酵母發(fā)酵對(duì)葡萄酒中香氣成分的種類(lèi)和含量均有較大影響。從不同酵母發(fā)酵的葡萄酒樣檢測(cè)到的60 種主要香氣成分中僅有11種共有成分，其中僅有3 種共有的主要香氣成分，它們分別是異戊醇、苯乙醇和異丁醇。自然發(fā)酵的葡萄酒樣中香氣成分最復(fù)雜，醇類(lèi)物質(zhì)含量最高；商業(yè)葡萄酒活性干酵母F15 產(chǎn)酯和產(chǎn)酸能力均最強(qiáng)；本土優(yōu)篩釀酒酵母菌株Y14 的產(chǎn)醇、產(chǎn)酯和產(chǎn)酸能力均為中等水平。

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