孫 軍，李 珍＊，張逸凡，楊武云，唐世新，胡晉紅＊

（1.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海200433；2.中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院藥物科學(xué)研究所藥物代謝研究中心，上海201203）

鹽酸帕洛諾司瓊（palonosetron hydrochloride）是高效、高選擇性的第二代5－羥色胺3（5－HT3）受體拮抗劑，其與5－HT3受體的親和力是其他5－HT3受體拮抗劑的100倍，半衰期也相對較長。臨床上用于預(yù)防癌癥化療藥物所致急性惡心、嘔吐和延遲性惡心、嘔吐［1］。重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責(zé)任公司研制的鹽酸帕洛諾司瓊注射液，經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)同意進(jìn)行臨床研究。本研究采用HPLC－MS／MS法測定帕洛諾司瓊的血漿藥物濃度，研究健康志愿者靜脈注射不同劑量鹽酸帕洛諾司瓊注射液后的代謝過程，評價其在健康人體的藥動學(xué)特征，為進(jìn)一步的臨床研究提供依據(jù)。

1 材 料

Agilent 1100液相色譜系統(tǒng)（包括G1311A四元泵、G1322A真空脫氣機(jī)、G1367A自動進(jìn)樣器和G1316A柱溫箱，美國Agilent公司）；TSQ QuantumUltra型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧電離源（ESI源）（美國Thermo Finnigan公司）；鹽酸帕洛諾司瓊對照品（含量99.6%，批號：041205－R）和鹽酸帕洛諾司瓊注射液（規(guī)格：5ml∶0.25mg）購自重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院；苦參堿對照品（含量100.2%，批號：81041125，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；甲醇、甲酸均為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 受試者的選擇 選擇健康受試者24名，性別不限，年齡18～40歲；體重指數(shù)19～24kg／m2；實(shí)驗(yàn)室檢查（血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化、胸片等）正常；無心、肝、腎、消化道和血液系統(tǒng)等疾病史；無煙酒嗜好。受試者試驗(yàn)前簽署書面知情同意書。試驗(yàn)方案經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用無對照開放平行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，24名健康受試者按隨機(jī)數(shù)字表法分配到低、中、高3個劑量組（0.25、0.50、0.75mg），每組各8例，進(jìn)行單次靜脈注射鹽酸帕洛諾司瓊注射液的藥動學(xué)研究。

2.3 給藥及樣品采集 采用單劑量靜脈注射給藥。受試者試驗(yàn)前1d進(jìn)食清淡晚餐后禁食12h。試驗(yàn)當(dāng)日清晨，參考藥品說明書，分別靜脈注射鹽酸帕洛諾司瓊注射液0.25、0.50、0.75mg，2min內(nèi)完成。于給藥前（0h）及給藥完成即刻和給藥后5、15、30min，1、2、4、6、8、12、24、48、72、120、168h從前臂靜脈取血3ml，置肝素化離心管中，2.0×102×g離心5min，取上清血漿，－20℃凍存，待測。

2.4 色譜和質(zhì)譜條件 色譜條件 Agilent Zorbax Extend C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；柱溫：室溫；流動相：甲醇－水－甲酸（60∶40∶0.2），流速：0.50ml／min，進(jìn)樣量：20μl。質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧電離源（ESI源），源噴射電壓為4 000V，加熱毛細(xì)管溫度為320℃，鞘氣（N2）流速10.5L／min，輔助氣（N2）流速1.5L／min，正離子方式檢測；掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）；碰撞氣（Ar）壓力0.16Pa。碰撞誘導(dǎo)解離（CID）電壓分別為30eV（帕洛諾司瓊）和40eV（內(nèi)標(biāo)苦參堿）；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m／z 297→110，188（帕洛諾司瓊），m／z249→148（內(nèi)標(biāo)苦參堿）。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 （1）精密稱取鹽酸帕洛諾司瓊對照品11.22mg（相當(dāng)于帕洛諾司瓊10.0mg），置于25ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成400mg／L的帕洛諾司瓊儲備液，以甲醇－水（50∶50）稀釋至所需濃度，得帕洛諾司瓊對照品溶液。（2）精密稱取10.0mg苦參堿，置于25ml容量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度，配制成400mg／L的儲備液，以甲醇－水（50∶50）稀釋得500μg／L的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.6 血漿樣品的處理 取血漿0.50ml加入40μl苦參堿內(nèi)標(biāo)溶液，100μl甲醇－水（50∶50）和200μl pH7.8的磷酸鹽緩沖液，混勻，加入4ml的提取溶劑：乙醚－二氯甲烷（3∶2），渦旋混合1min后往復(fù)振蕩15min，1.08×103×g離心5min；分取上清液于另一10ml具塞試管中，40℃空氣流吹干，200μl流動相復(fù)溶殘?jiān)瑴u旋混勻，20μl進(jìn)樣分析。

2.7 數(shù)據(jù)處理 采用DAS 2.0軟件進(jìn)行藥動學(xué)數(shù)據(jù)處理。采用梯形法計(jì)算AUC0～t值，AUC0～∞＝AUC0～t＋ct／Ke（ct為最后一個可測時間點(diǎn)的血藥濃度）；tmax和cmax采用實(shí)測值；以血藥濃度對時間作半對數(shù)曲線，取消除相時間點(diǎn)進(jìn)行線性擬合，求算消除速率常數(shù)Ke，t1／2β＝0.693／Ke；CL＝D／AUC0～∞（D為給藥劑量），Vd＝CL／Ke；平均駐留時間（mean retention time，MRT）＝一階矩曲線下面積（AUMC）／AUC。對不同劑量的主要藥動學(xué)參數(shù)與劑量進(jìn)行相關(guān)性分析。

2.8 分析方法驗(yàn)證

2.8.1 方法的特異性 帕洛諾司瓊和內(nèi)標(biāo)苦參堿在（＋）ESI電離方式下，主要生成［M＋H］＋峰，分別為m／z297和249。選擇性對［M＋H］＋峰進(jìn)行產(chǎn)物離子全掃描質(zhì)譜分析，帕洛諾司瓊生成的主要碎片離子有m／z 110和188，苦參堿生成的主要碎片離子為m／z148。

取6名受試者的空白血漿0.50ml，除不加內(nèi)標(biāo)外，其他按2.6項(xiàng)下操作，進(jìn)樣20μl，得色譜圖（見圖1A）；將一定濃度的帕洛諾司瓊對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿中，同法操作，得色譜圖（見圖1B）；帕洛諾司瓊和內(nèi)標(biāo)苦參堿的保留時間分別為3.33和2.47min。取受試者給藥后的血漿樣品，按2.6項(xiàng)下操作，進(jìn)樣20μl，得色譜圖（見圖1C）。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾帕洛諾司瓊和內(nèi)標(biāo)苦參堿的測定。

2.8.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 取空白血漿0.50ml，加系列對照品溶液100μl，配制成相當(dāng)于帕洛諾司瓊血漿濃度0.01、0.03、0.08、0.20、0.80、2.0、8.0、20.0、50.0μg／L的樣品，按2.6項(xiàng)下操作，進(jìn)樣20μl。以待測物濃度為橫坐標(biāo)（X），待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），采用加權(quán)（W＝1／X2）最小二乘法進(jìn)行回歸，得回歸方程：Y＝0.100 9 X＋0.001 0（r＝0.996 8）。結(jié)果表明，帕洛諾司瓊血藥濃度在0.01～50μg／L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。定量下限為0.01μg／L，RSD＝6.9%，RE＝5.3%（n＝6）。

2.8.3 方法的回收率和精密度 取空白血漿0.50ml，加系列對照品溶液100μl，配制成相當(dāng)于帕洛諾司瓊血漿濃度0.025、0.500和40.0μg／L的質(zhì)控樣品。取上述3個濃度的血漿質(zhì)控樣品，按2.6項(xiàng)下操作，于1d內(nèi)測定6次，計(jì)算日內(nèi)RSD；連續(xù)測定3d，計(jì)算日間RSD，結(jié)果見表1。另取空白血漿0.50ml，除不加內(nèi)標(biāo)外，按2.6項(xiàng)下操作，向獲得的全部上清液中加入相應(yīng)濃度的對照品溶液100μl和內(nèi)標(biāo)溶液40μl，渦旋混合，40℃空氣流吹干，200μl流動相復(fù)溶殘?jiān)?，渦旋混勻，20μl進(jìn)樣分析，得相應(yīng)峰面積。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

圖1 血漿中帕洛諾司瓊和內(nèi)標(biāo)苦參堿的HPLC－MS／MS譜圖Figure 1 HPLC－MS／MS photograms of palonosetron and internal standard matrine in human plasma

表1 帕洛諾司瓊的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recovery rate and precision test of palonosetron（n＝6，±s，%）

表1 帕洛諾司瓊的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recovery rate and precision test of palonosetron（n＝6，±s，%）

（ρB／μg·L－1） 方法回收率濃度 提取回收率日內(nèi)RSD日間RSD 0.025 103.3±4.7 86.4±6.8 6.9 2.2 0.500 97.7±4.2 84.4±8.5 4.8 8.5 40.0 105.1±6.5 88.5±5.3 6.4 9.4

2.8.4 樣品的穩(wěn)定性考察 本研究考察了帕洛諾司瓊血漿樣品（0.025和40.00μg／L）于室溫放置2h、－20℃放置6個月、3次凍融循環(huán)，以及萃取后室溫放置24h的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，帕洛諾司瓊血漿樣品放置2h（RE 0.9%～4.1%）、萃取后室溫放置24h（RE－8.0%～9.4%）、－20℃放置6個月（RE 5.7%～6.7%）、血漿樣品經(jīng)過3次凍融循環(huán)（RE－3.8%～－1.3%）均穩(wěn)定。

2.9 藥動學(xué)研究 24名健康受試者單次靜脈注射鹽酸帕洛諾司瓊后平均血藥濃度－時間曲線見圖2。帕洛諾司瓊的血漿濃度呈雙指數(shù)下降，開始為迅速的分布相，隨后為較慢的消除相。經(jīng)過模型擬合，帕洛諾司瓊在受試者體內(nèi)的藥動學(xué)過程符合二室開放模型，主要藥動學(xué)參數(shù)見表2。帕洛諾司瓊在體內(nèi)的暴露量（cmax和AUC）隨著劑量的增加（0.25～ 0.75mg）而增加，AUC與劑量的增加呈線性關(guān)系，t1／2、CL和Vd無劑量依賴性。

圖2 靜脈注射3個劑量的鹽酸帕洛諾司瓊注射液后的血藥濃度－時間曲線Table 2 Concentration－time curves of palonosetron after administration of three doses of palonosetron hydrochloride injection by intravenous infusion

2.10 安全性評價 在試驗(yàn)過程中，醫(yī)護(hù)人員對受試者的不良反應(yīng)進(jìn)行了嚴(yán)密觀察。19名受試者在試驗(yàn)過程中出現(xiàn)輕度腹痛、腹脹、大便干燥、大便次數(shù)減少等消化道癥狀；6例次出現(xiàn)輕度乏力、惡心、頭暈、頭痛等癥狀；以上所有癥狀均未處理，自行緩解。這些癥狀的出現(xiàn)可能與帕洛諾司瓊作用于胃腸道和中樞5－HT3受體有關(guān)。

3 討 論

化療引起的惡心、嘔吐是腫瘤病人在化療過程中最常見的不良反應(yīng)，預(yù)防化療所致的惡心、嘔吐對改善病人生活質(zhì)量并保證化療的順利進(jìn)行具有重要意義。鹽酸帕洛諾司瓊是第二代5－HT3受體拮抗劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與第一代同類產(chǎn)品不同，它由一個融合的三環(huán)結(jié)構(gòu)與喹核堿相連。這種結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)決定了帕洛諾司瓊與第一代5－HT3受體拮抗劑相比，與受體的結(jié)合力強(qiáng)30～100倍，t1／2β也較現(xiàn)有5－HT3受體拮抗劑明顯延長。

表2 靜脈注射3個劑量的鹽酸帕洛諾司瓊注射液后的藥動學(xué)參數(shù)Table 2 Pharmacokinetic parameters of palonosetron after administered three doses of palonosetron hydrochloride injection by intravenous infusion（n＝8，±s）

表2 靜脈注射3個劑量的鹽酸帕洛諾司瓊注射液后的藥動學(xué)參數(shù)Table 2 Pharmacokinetic parameters of palonosetron after administered three doses of palonosetron hydrochloride injection by intravenous infusion（n＝8，±s）

Ke：消除速率常數(shù)；MRT：平均駐留時間

組別 cmax（ρВ／μg·L－1） tmax（t／h） AUC0～t（A／μg·h·L－1）AUC0～∞（A／μg·h·L－1） t1／2β（t／h） Ke（1／h） CL（L／h） Vd（V／L） MRT（t／h）0.25mg組5.57±2.97 0.03±0.00 24.3±7.6 25.0±8.0 31.0±5.6 0.023±0.004 11.0±3.6 495±208 41.7±6.2 0.50mg組6.84±5.48 0.03±0.00 48.3±14.6 50.2±16.1 33.5±5.6 0.021±0.003 11.0±4.1 513±138 45.5±9.0 0.75mg組9.75±5.78 0.07±0.08 74.7±25.4 76.8±27.2 31.1±5.0 0.023±0.003 10.7±3.1 463±91 42.4±7.9

與以往研究方法的強(qiáng)堿性流動相（pH 9.5）相比，本研究采用的流動相為甲醇－水－甲酸（60∶40∶2），色譜柱的適用性相對會更好一些。

文獻(xiàn)［2］報(bào)道帕洛諾司瓊在0.3～90μg／kg劑量下，在美國和日本的健康受試者中，帕洛諾司瓊暴露量隨著劑量增加而增加，t1／2β、CL和Vd無劑量依賴性。本研究結(jié)論與以上報(bào)道相似。靜脈注射3種劑量鹽酸帕洛諾司瓊注射液后，其在健康人體內(nèi)的消除半衰期相近，說明在0.25～0.75mg劑量范圍內(nèi)鹽酸帕洛諾司瓊呈線性藥動學(xué)特征。國內(nèi)外研究［3－5］表明，靜脈注射鹽酸帕洛諾司瓊后，Vd值較大，而CL相對較低，提示帕洛諾司瓊在人體內(nèi)分布廣泛，消除卻相對緩慢，因此半衰期較長。帕洛諾司瓊的長效特征除與其代謝、消除緩慢有關(guān)外，與該藥與5－HT3受體結(jié)合的特點(diǎn)也有關(guān)［6］。鑒于以上原因，對該藥短期內(nèi)的頻繁給藥（每日連續(xù)或隔日交替）需謹(jǐn)慎考慮。

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