陳 芳，胡晉紅，朱全剛（第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上海200433）

咳喘膏是目前臨床常用于治療單純型慢性氣管炎、喘息型慢性氣管炎、哮喘（除心臟引起的）等癥的外用中藥復(fù)方制劑，由芥子、甘遂、延胡索、細(xì)辛、洋金花等中藥與適當(dāng)基質(zhì)制成。洋金花是其中一味非常重要的中藥，其主要有效成分東莨菪堿具有廣泛的藥理活性，如解痙、麻醉、止痛等。為進(jìn)一步研究咳喘膏經(jīng)皮給藥的體內(nèi)過程，本研究將氫溴酸東莨菪堿制成凝膠制劑，用微透析取樣技術(shù)研究其在大鼠皮膚內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程。

經(jīng)皮微透析技術(shù)可以對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人體皮膚組織進(jìn)行在體、連續(xù)的藥物濃度測(cè)定，現(xiàn)已被廣泛用于外用制劑的在體經(jīng)皮吸收動(dòng)力學(xué)研究。但所收集的微透析樣品中藥物濃度非常低，一般在納克每毫升甚至皮克每毫升范圍，并且由于微透析流速低，所收集的樣品量一般只有幾微升至幾十微升。樣品量少、濃度低的特點(diǎn)對(duì)建立分析方法提出了挑戰(zhàn)［1］。HPLC－MS／MS法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、樣品需求量少的特點(diǎn)。本研究建立了HPLC－MS／MS法測(cè)定微透析樣品中東莨菪堿的濃度，并研究了氫溴酸東莨菪堿凝膠的大鼠經(jīng)皮給藥藥動(dòng)學(xué)過程。

1 材 料

1.1 藥物和試劑 氫溴酸東莨菪堿原料藥（廣州環(huán)葉制藥有限公司，批號(hào)070301）；氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品（德國(guó)MSDS公司，純度≥98%）；甲醇（色譜純，美國(guó)Tedia公司）；甲酸銨、甲酸和三乙醇胺（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA－2Na），磷酸氫二鈉（汕頭金沙化工一廠）；磷酸二氫鈉（新華化工廠）；NaCl（泰昌美達(dá)試劑有限公司）；卡波姆（美國(guó)Lubrizol公司）；羥苯乙酯（湖北合天化工有限公司）；丙二醇（宜興市毅達(dá)化工廠）；月桂氮酮（湖北南星化工總廠）。氫溴酸東莨菪堿凝膠由第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器 G－6410AHPLC－MS／MS聯(lián)用儀（配有三重四級(jí)桿LC－MS系統(tǒng)、G1311四元泵、G1322真空泵、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器和G1316A柱溫箱），Zorbax Extend C18保護(hù)柱，Zorbax Extend C18色譜柱（美國(guó)安捷倫公司）。微透析系統(tǒng)：MD1001灌注器推進(jìn)泵、MD0100灌注器、MD1002灌注器支架和MD1020流速控制器（美國(guó)BAS公司）。Franz擴(kuò)散池（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院有機(jī)所玻璃車間加工制備）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，體重約200g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2007－0003。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 Zorbax Extend C18色譜柱（100mm×2.1mm，3.5μm），Zorbax Extend C18保護(hù)柱（12.5mm×2.1mm，5μm），流動(dòng)相：甲醇－2mmol／L甲酸銨（25∶75，用甲酸調(diào)節(jié)pH 3.5），流速：0.3ml／min；進(jìn)樣量：1μl；柱溫40℃。

2.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧電離源（ESI），正離子掃描方式及多離子反應(yīng)方式檢測(cè)；離子源溫度350℃；鞘氣（N2）流速8L／min；霧化氣壓30Pa；毛細(xì)管電壓4 000V；檢測(cè)時(shí)間3min。在一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖中獲得氫溴酸東莨菪堿準(zhǔn)分子離子峰為m／z 304.1，選擇性對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到主要碎片離子為m／z138.0（見圖1），儀器自動(dòng)優(yōu)化相對(duì)碰撞能量為23。將上述離子對(duì)用于定量分析。

2.3 磷酸鹽緩沖液溶液（PBS）的配制 分別稱取磷酸二氫鈉0.775g，磷酸氫二鈉3.171g，氯化鈉5.58g溶解于蒸餾水中，定容至1 000ml，用0.45μm的水系微孔濾膜過濾即得pH 7.4的PBS。2.4 儲(chǔ)備液、對(duì)照品溶液、質(zhì)控溶液的配制 精密稱取適量氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品置于100ml容量瓶中，用PBS溶解并稀釋至刻度，配制成10μg／ml的東莨菪堿儲(chǔ)備液。依次精密量取該儲(chǔ)備液適量，置于10ml容量瓶中，用PBS稀釋至刻度，搖勻，配制成5、10、20、50、100、200、500、1 000ng／ml的對(duì)照品溶液。同法配制20、100、500ng／ml的東莨菪堿質(zhì)控溶液。

圖1 東莨菪堿的HPLC－MS／MS譜圖Figure 1 HPLC－MS／MS photogram of scopolamine

2.5 微透析樣品處理 取5μl微透析溶液加入45μl PBS，混勻，渦旋3min，取5μl進(jìn)行HPLC－MS／MS分析。

2.6 氫溴酸東莨菪堿凝膠處方及制作方法 處方：氫溴酸東莨菪堿0.5g，卡波姆1g，EDTA－2Na 0.03g，羥苯乙酯0.1g，丙二醇10ml，月桂氮酮5ml，三乙醇胺0.5ml，蒸餾水適量。制作方法：精密稱取處方量氫溴酸東莨菪堿，用適量蒸餾水溶解，加入處方量卡波姆，溶脹過夜，此為1液。處方量EDTA－2Na用適量蒸餾水溶解，此為2液。將2液緩緩加入1液得3液。羥苯乙酯的丙二醇溶液緩慢加入3液，邊加邊攪拌。再先后加入月桂氮酮、三乙醇胺，用蒸餾水補(bǔ)足至100g，即得凝膠。

2.7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理 SD大鼠3只，體重約200g，實(shí)驗(yàn)前一晚禁食。實(shí)驗(yàn)前用25%烏拉坦溶液3ml／kg腹腔注射麻醉動(dòng)物，固定動(dòng)物后在腹部剃除毛發(fā)，置皮膚微透析探針，將探針連接于微透析裝置。

2.8 大鼠體內(nèi)東莨菪堿回收率測(cè)定 用含不同濃度東莨菪堿的PBS（約20、100、200ng／ml，HPLC－MS／MS法測(cè)定灌流液中具體濃度cperf）灌注探針，流速2μl／min，平衡1h后，每20min收集一次透析液，收集4個(gè)樣品后，更換高濃度的灌流液，依前面的方法平衡采樣，直至采集好3個(gè)濃度的樣品。HPLC－MS／MS進(jìn)樣5μl，測(cè)定透析液中的藥物濃度（cdial），根據(jù)公式Rdial＝（cperf－cdial）／cperf計(jì)算濃度對(duì)東莨菪堿體內(nèi)回收率的影響。結(jié)果3種不同濃度東莨菪堿在大鼠體內(nèi)回收率分別為（35.21± 1.88）%、（33.14±4.60）%和（31.15±1.09）%（n＝3）。用含藥濃度為200ng／ml的PBS在不同流速下（1.0、1.5、2.0、3.0μl／min）灌注探針。每種流速收集前平衡1h，各收集5份微透析樣品，計(jì)算流速對(duì)東莨菪堿體內(nèi)回收率的影響。不同流速下東莨菪堿在大鼠體內(nèi)回收率分別為（90.34±2.53）%、（51.80±2.08）%、（29.62±2.79）%和（17.22± 2.70）%（n＝5）。

2.9 氫溴酸東莨菪堿凝膠體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn) 將透皮擴(kuò)散池預(yù)熱至34℃，將大鼠皮膚置于裝有磁力攪拌子的Franz擴(kuò)散池上，真皮層朝上。凝膠0.5g／池，均勻涂于皮膚表面，固定擴(kuò)散池。在接收池中加入預(yù)熱至34℃的PBS，開磁力攪拌，開始計(jì)時(shí)，分別于1、2、4、6、8、12h從接收池中取出全部接收液，并及時(shí)補(bǔ)充等量34℃的PBS。接收液于5.71×10－3×g離心10min，然后進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果凝膠中藥物透過皮膚的滲透曲線見圖2。以單位面積累計(jì)經(jīng)皮滲透量對(duì)時(shí)間進(jìn)行線性回歸，得出凝膠劑中藥物經(jīng)皮滲透速率為112.14μg·cm－2·h－1，時(shí)滯為3.5h。

圖2 氫溴酸東莨菪堿凝膠大鼠體外經(jīng)皮滲透曲線Figure 2 The in vitro permeation curve of scopolamine hydrobromide gel in rats

2.10 氫溴酸東莨菪堿凝膠的經(jīng)皮吸收藥動(dòng)學(xué)過程 用不含藥物的PBS灌注探針90min后，在透析窗正上方局部皮膚用0.5%氫溴酸東莨菪堿凝膠（1.25mg／cm2）包封，平衡30min后，每隔20min收集1次透析液，收集12h。該凝膠經(jīng)皮給藥后20min～12h內(nèi)均可檢測(cè)到東莨菪堿的存在，且給藥后藥物在皮膚內(nèi)濃度迅速升高，約150min時(shí)達(dá)到峰濃度，為（951.6±56.1）ng／ml，隨后下降但其濃度能穩(wěn)定在較高的水平（445～992ng／ml）。氫溴酸東莨菪堿在皮膚內(nèi)的t1／2為（174.2±77.3）min，AUC0～t為（355 764.4±38 138.9）ng·min·L－1，經(jīng)皮吸收動(dòng)力學(xué)曲線見圖3。

2.11 方法學(xué)考察

2.1 1.1 方法專屬性 取大鼠空白皮膚下微透析樣品進(jìn)行HPLC－MS／MS分析，大鼠腹部皮膚給予東莨菪堿凝膠2h后取皮膚下微透析樣品。結(jié)果表明，空白皮膚下未見待測(cè)物本底以及其他干擾物質(zhì)影響氫溴酸東莨菪堿的測(cè)定。

2.1 1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考文獻(xiàn)［2，3］，以PBS作為空白基質(zhì)，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品，得離子流圖。以待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以待測(cè)物的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），用加權(quán)（權(quán)重系數(shù)1／X2）最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y＝0.6 X＋0.001 6（r＝0.999 8）。東莨菪堿在5.0～1 000ng／ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖3 氫溴酸東莨菪堿凝膠經(jīng)皮吸收動(dòng)力學(xué)曲線Figure 3 The percutaneous absorption kinetics curve of scopolamine hydrobromide gel n＝3

2.1 1.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取20、100、500ng／ml的質(zhì)控溶液，每個(gè)濃度進(jìn)行5個(gè)樣本分析，連續(xù)測(cè)定3d，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的濃度，考察日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果其日內(nèi)RSD分別為1.81%、0.60%、0.57%（n＝5）；日間RSD分別為3.00%、0.33%、0.32%（n＝5），表明精密度良好。

3 討 論

微透析樣品體積小，所含被測(cè)物的濃度一般都比較低，因此對(duì)分析方法的靈敏度要求很高，HPLC－MS／MS法因其具有高效、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，因而在微透析樣品的分析中越來(lái)越受到重視。將探針埋置人皮下所造成的創(chuàng)傷是很輕微的，但是也有可能產(chǎn)生紅斑、組織中小分子物質(zhì)濃度和組織血液灌流量改變，影響研究結(jié)果。因此國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道在埋置探針后到局部給藥前應(yīng)有一段平衡時(shí)間，通常為60～90min［4，5］。

在微透析取樣方法中，探針回收率的準(zhǔn)確校正是獲得組織液內(nèi)真實(shí)藥物濃度的關(guān)鍵。最常用的用于校準(zhǔn)探針回收率的方法有慢流速法、零凈流量法、內(nèi)標(biāo)法和反向透析法。反向透析法由于更快速和更方便的優(yōu)勢(shì)而被廣泛用于體內(nèi)回收率的測(cè)定。本研究就是采用反向透析法測(cè)定探針的回收率，且從結(jié)果可以看出探針的回收率與藥物濃度無(wú)關(guān)。

從氫溴酸東莨菪堿凝膠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程可以看出，該藥物能迅速透過皮膚被吸收，約在150min時(shí)即達(dá)到最高濃度，后緩慢下降但濃度能維持在一較高的范圍內(nèi)，隨后該藥物在皮下的濃度迅速下降，提示臨床使用該藥物時(shí)需注意給藥間隔。本研究成功建立了HPLC－MS／MS法檢測(cè)大鼠皮下微透析樣品中東莨菪堿的含量，并考察了氫溴酸東莨菪堿凝膠經(jīng)皮給藥后在皮下的藥動(dòng)學(xué)過程。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，氫溴酸東莨菪堿凝膠的皮下濃度在各個(gè)探針和大鼠之間有差異，推測(cè)造成該差異的原因可能是各大鼠對(duì)藥物的皮膚屏障作用以及皮膚代謝和皮膚清除作用不一致，而非微透析技術(shù)自身缺陷所造成［2］。

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