呂 慧，王國坤，劉 博，李松華，秦永文（第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院心血管內科，上海200433）

經皮冠狀動脈介入術（percutaneous coronary intervention，PCI）對心絞痛及心肌梗死的再血管化治療具有重要作用，但術后支架內再狹窄（in－stent restenosis，ISR）一度成為支架植入的障礙。曾有文獻報道可明顯減少ISR的藥物洗脫支架的再狹窄率在糖尿病病人中高達20.9%，即使在非糖尿病病人中也達到14.6%［1］。他汀類藥物可抑制人體膽固醇生物合成，在心血管疾病中廣泛應用于治療高膽固醇血癥，發(fā)揮穩(wěn)定斑塊、抗炎等作用。既往已有研究表明，他汀類藥物可明顯減少PCI后再狹窄率的發(fā)生［2］，而內皮細胞的活化及血管新生在ISR的病理生理過程中發(fā)揮了重要作用［3］，推測他汀類藥物可能影響血管新生過程發(fā)揮心血管保護作用。

為能實時活體觀察他汀類藥物對血管新生的影響，作者使用轉基因斑馬魚作為實驗對象。通過研究瑞舒伐他汀鈣對斑馬魚血管發(fā)育的影響，間接揭示他汀類藥物影響血脂之外的作用，為血管新生相關PCI后再狹窄的治療提供新的參考。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器 動物模型為轉基因斑馬魚Tg（flk1：EGFP），系中國科學院上海生命科學研究院饋贈；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；PrimeScript RT試劑盒（日本Takara公司）；雷鳥定量PCR試劑（日本Toyobo公司）；體視熒光顯微鏡（德國萊卡儀器有限公司）。瑞舒伐他汀鈣片（10mg／片，批號113651，阿斯利康制藥公司）。

1.2 藥物溶液制備 根據(jù)Westerfield［4］方案配制魚卵水（egg water，137mmol／L NaCl，5.4mmol／L KCl，0.13mmol／L CaCl2，0.1mmol／L Mg2＋，pH 7.2），將瑞舒伐他汀鈣片研磨成粉后溶入二甲亞砜（DMSO）終濃度為0.5%的魚卵水中，藥物濃度梯度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.10nmol／L。

1.3 胚胎處理 根據(jù)Westerfield［4］方案飼養(yǎng)，28.5℃下照明14h／黑暗10h為一個周期，飼養(yǎng)水連續(xù)充氧氣，水為半自動更新，定時給予飼料草履蟲。取卵前1d，雌雄斑馬魚以1／2的比例放入交配缸內，交配缸底部有產卵托盤，中間放置隔板，過夜，次日晨照明后去掉隔板1h內取胚胎。使用24孔板，每孔中至少20個胚胎，加入不同濃度的藥物，形成藥物的不同濃度梯度。從受精卵形成后0.5h開始刺激，持續(xù)24h。受精后24h觀察斑馬魚的血管發(fā)育情況。實驗組每孔加入上述不同濃度藥物2ml，對照組每孔加入含0.5%DMSO的魚卵水。

1.4 定量聚合酶鏈反應 使用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT－PCR），檢測不同時期胚胎血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF－A）的表達量。以管家基因甘油醛－3－磷酸脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參，根據(jù)斑馬魚GAPDH和VEGF－A基因序列，利用Primer 5.0軟件設計引物進行擴增。GAPDH及VEGF－A的引物分別為：VEGF－A F：5′－CGAAACGTCACTATGGAGGTG－3′；VEGF－A R：5′－GCAAGGCTCACAGTGGTTTT－3′；GAPDH F：5′－CAGGCATAATGGTTAAAGTTGGTA－3′；GAPDH R：5′－CATGTAATCAAGGTCAATGAATGG－3′。按Trizol試劑說明書操作，分別提取0、6、12和24h斑馬魚胚胎總RNAs，使用PrimeScript RT試劑盒將總RNAs反轉錄為cDNA。將所得的cDNA產物置于－20℃保存。以反轉錄所得cDNA體積的1／20為模板，使用雷鳥定量PCR試劑行定量PCR。擴增條件為：95℃預變性1min，94℃變性20s，58℃退火20s，72℃延伸15s，40個循環(huán)，最后72℃溫育10min。建立PCR產物的溶解曲線，以鑒定產物是否單一。擴增產物以1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，采用Rotor Gene 6軟件進行VEGF－A與GAPDH基因條帶的相對密度分析。數(shù)據(jù)分析采用2—△△ct的方法。

1.5 統(tǒng)計學處理 計算被抑制的節(jié)間血管的數(shù)目，應用統(tǒng)計分析軟件SPSS14.0對實驗組和對照組中節(jié)間血管異常的斑馬魚進行統(tǒng)計學分析，實驗結果以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗計算組間差異，P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 瑞舒伐他汀鈣可抑制斑馬魚血管發(fā)育 使用0.01、0.02、0.04、0.08、0.10nmol／L 5個不同濃度的瑞舒伐他汀鈣處理斑馬魚胚胎，發(fā)育至受精后24hours post fertilization（hpf）。使用熒光顯微鏡觀察5個藥物濃度下胚胎的新生節(jié)間血管（intersegmental vessels，ISVs）生長情況，發(fā)現(xiàn)0.08nmol／L的藥物處理后ISVs較對照組生長速度明顯受到抑制，多數(shù)表現(xiàn)為節(jié)間血管長度較對照組明顯減少或缺失（如圖1所示）。通過軟件計算上述5個濃度組藥物處理后胚胎的ISVs長度分別為：（0.045±0.002）、（0.042±0.001）、（0.041±0.001）、（0.028±0.002）、（0.031±0.001）mm，與對照組（0.050±0.001）mm相比，5個濃度藥物處理后的胚胎節(jié)間血管長度均有減少，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖1 兩組斑馬魚胚胎在受精后24h時節(jié)間血管生長情況Figure 1 The growth of intersegmental vessels of zebrafish embryos at 24hours post fertilization in the two groups

2.2 瑞舒伐他汀鈣可抑制受精后24h胚胎VEGF－A的表達 選取斑馬魚胚胎最初生長的4個時期，即受精后0、6、12和24hpf，觀察藥物對血管抑制效果最強的濃度，即0.08nmol／L的瑞舒伐他汀鈣處理胚胎后4個時間點VEGF－A的表達變化。結果顯示，隨著時間延長，對照組及實驗組胚胎VEGF－A表達量均呈現(xiàn)增加趨勢，同時，與同時期對照組相比，0、6、12hpf實驗組的VEGF－A表達量未見明顯降低，而在24hpf的表達量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果見表1。

表1 兩組不同時期斑馬魚胚胎血管內皮生長因子A的相對表達量Table 1 Relative expression quantity of vascular endothelial growth factor A at different time of zebrafish embryos in the two groups（n＝4，±s）

表1 兩組不同時期斑馬魚胚胎血管內皮生長因子A的相對表達量Table 1 Relative expression quantity of vascular endothelial growth factor A at different time of zebrafish embryos in the two groups（n＝4，±s）

＊P＜0.05，與相同時間點的對照組比較

組別 0hpf 6hpf 12hpf 24hp f對照組 1.062± 0.0050.002實驗組 1.071± 0.007 1.341± 0.002 2.282± 0.006 3.315± 1.349± 0.001 2.171± 0.011 2.607± 0.020＊

3 討 論

ISR是PCI后的主要不良事件，它與手術引起的血管損傷相關，多種因素如血栓形成、炎癥、內皮細胞增殖及細胞外間質形成等均參與其病理生理過程［5］。既往數(shù)十年，已有多項隨機的回顧性研究表明，他汀類藥物較對照組可顯著減少PCI后6個月血管再狹窄的發(fā)生率［6，7］。本研究結果表明，瑞舒伐他汀鈣可明顯抑制斑馬魚胚胎血管新生，與Walter等［6］的研究結果一致，從一定程度上反映出他汀類藥物對PCI后再狹窄的預防作用。

斑馬魚作為研究脊椎動物發(fā)育生物學的理想實驗動物，具有胚胎透明、產卵量大、便于觀察等特點，同時其血管生成過程與脊椎動物具有高度保守性。目前使用的轉基因斑馬魚攜帶特定啟動子與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因相連，方便使用熒光顯微鏡觀察血管發(fā)育。

瑞舒伐他汀鈣抑制血管增生的作用通路尚不明確，通過行實時定量RT－PCR，作者檢測了斑馬魚整胚VEGF－A的相對表達量。對照組可見VEGF－A呈明顯上升趨勢，早期（0～6hpf）VEGF－A沒有明顯升高，且本身表達量較少，12hpf后斑馬魚VEGF－A表達量增多，表明在斑馬魚血管發(fā)育期間，VEGF－A發(fā)揮了重要作用，與Liang等［8］的研究結果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，藥物處理后的胚胎VEGF－A的表達量雖呈上升趨勢，但較對照組在24hpf時的表達量明顯減少，表明藥物可能影響整個胚胎VEGF－A的表達，而節(jié)間血管作為血管發(fā)育的明顯標志，表現(xiàn)為長度的明顯減少。既往研究表明，斑馬魚的VEGF－A基因與人類相似［9］，因此可合理推測臨床使用瑞舒伐他汀鈣可減少病人VEGF－A的表達而發(fā)揮預防支架內再狹窄的作用。但是，目前的研究結果僅為藥物作用的初步研究，同時研究結果表明，瑞舒伐他汀鈣抑制血管新生后可能影響PCI后血管損傷后的新生血管修復，或影響早期動脈粥樣硬化表面纖維帽的穩(wěn)定性而導致斑塊易破裂。目前的數(shù)據(jù)仍然支持他汀類藥物應用于預防斑塊形成及支架內再狹窄［10］。本研究可為他汀類藥物抗動脈粥樣硬化及抗腫瘤作用提供一定的理論依據(jù)，同時為他汀類藥物在抗血管新生方面的爭議提供依據(jù)。

［1］ Hong S J，Kim M H，Ahn T H，et al.Multiple predictors of coronary restenosis after drug－eluting stent implantation in patients with diabetes［J］.Heart，2006，92（8）：1119－1124.

［2］ Kamishirado H，Inoue T，Sakuma M，et al.Effects of statins on restenosis after coronary stent implantation［J］.Angiology，2007，58（1）：55－60.

［3］ 湯學超，秦永文.經皮冠狀動脈介入術前他汀類藥物預治療：消炎與心肌保護［J］.藥學服務與研究，2010，10（5）：364－367.

Tang XueChao，Qin YongWen.Pretreatment with statins before percutaneous coronary intervention：anti－inflammatory effect and cardioprotection［J］.Pharm Care Res，2010，10（5）：364－367.In Chinese with English abstract.

［4］ Westerfield M，Doerry E，Douglas S.Zebrafish in the net［J］.Trends Genet，1999，15（6）：248－249.

［5］ Rajagopal V，Rockson S G.Coronary restenosis：a review of mechanisms and management［J］.Am J Med，2003，115（7）：547－553.

［6］ Walter D H，Sch?chinger V，Elsner M，et al.Effect of statin therapy on restenosis after coronary stent implantation［J］.Am J Cardiol，2000，85（8）：962－968.

［7］ Bunch T J，Muhlestein J B，Anderson J L，et al.Effects of statins on six－month survival and clinical restenosis frequency after coronary stent deployment［J］.Am J Cardiol，2002，90（3）：299－302.

［8］ Liang D，Chang J R，Chin A J，et al.The role of vascular endothelial growth factor（VEGF）in vasculogenesis，angiogenesis，and hematopoiesis in zebrafish development［J］.Mech Dev，2001，108（1－2）：29－43.

［9］ Gong BaiWei，Liang Dong，Chew TingGang，et al.Characterization of the zebrafish vascular endothelial growth factor A gene：comparison with vegf－Agenes in mammals and Fugu［J］.Biochim Biophys Acta，2004，1676（1）：33－40.

［10］ Katsiki N，Tziomalos K，Chatzizisis Y，et al.Effect of HMGCoA reductase inhibitors on vascular cell apoptosis：beneficial or detrimental？［J］.Atherosclerosis，2010，211（1）：9－14.