張 玉,熊正愛(ài)△,華媛媛,章錫明,姚陳果

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科 400010;2.重慶大學(xué)輸配電裝備及系統(tǒng)安全與新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 400030)

高強(qiáng)度皮秒脈沖電場(chǎng)對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞體外作用初探*

張 玉1,熊正愛(ài)1△,華媛媛1,章錫明2,姚陳果2

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科 400010;2.重慶大學(xué)輸配電裝備及系統(tǒng)安全與新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 400030)

目的探討高強(qiáng)度皮秒脈沖電場(chǎng)對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的體外損傷效應(yīng)及機(jī)制?方法 固定皮秒脈沖電場(chǎng)脈寬800 ps?頻率3Hz?場(chǎng)強(qiáng)250kV/cm,根據(jù)處理脈沖個(gè)數(shù)不同(0?1 000?3 000和5 000個(gè)),將HeLa細(xì)胞分為對(duì)照組和不同劑量皮秒脈沖處理組,通過(guò)MTT比色法檢測(cè)皮秒脈沖對(duì)各組細(xì)胞在處理后不同時(shí)間點(diǎn)生長(zhǎng)抑制的影響;Fluo-3/AM探針標(biāo)記細(xì)胞,激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞[Ca2+]i改變;Western blot法檢測(cè)皮秒脈沖電場(chǎng)作用后Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)量的改變?結(jié)果隨著脈沖劑量的增加,細(xì)胞死亡率上升,生長(zhǎng)受到抑制,12h時(shí)抑制率最為顯著;皮秒脈沖處理可明顯升高細(xì)胞[Ca2+]i(P0.05);隨著脈沖劑量的增加,細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白表達(dá)量由對(duì)照組的0.205±0.102增加至各處理組的0.257±0.083?0.586±0.138和0.791±0.262(P0.05);Bcl-2蛋白表達(dá)量由對(duì)照組的0.694±0.132降低至各處理組的0.591±0.145?0.364±0.105和0.262±0.092(P0.05);Bax/Bcl-2比值顯著上調(diào)(P0.05)?結(jié)論高強(qiáng)度皮秒脈沖電場(chǎng)對(duì)HeLa細(xì)胞有損傷效應(yīng),并能誘導(dǎo)其凋亡?

電磁場(chǎng);脈沖療法;細(xì)胞凋亡;腫瘤細(xì)胞,培養(yǎng)的

因皮秒脈沖具有超寬帶脈沖頻譜,可以通過(guò)匹配超寬帶沖激脈沖輻射天線進(jìn)行發(fā)射,并將脈沖電場(chǎng)聚焦于特定組織,從而為實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)治療提供了可能[7]?且前期研究結(jié)果表明,當(dāng)電場(chǎng)脈沖脈寬由毫秒或微秒級(jí)降低至納秒級(jí)時(shí),其對(duì)細(xì)胞的作用靶點(diǎn)逐漸由細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)結(jié)構(gòu)[8-10]?如進(jìn)一步將脈沖電場(chǎng)脈寬降低至皮秒級(jí),其靶向作用于胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的效應(yīng)是否更加明顯?是否可以直接作用于胞內(nèi)細(xì)胞器(如線粒體?內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等),進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡?基于以上物理特性及假設(shè),本實(shí)驗(yàn)對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),初步探討皮秒脈沖對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物電學(xué)損傷效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制,為基于靶向誘導(dǎo)凋亡的無(wú)創(chuàng)治療技術(shù)提供基礎(chǔ)研究?

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 HeLa細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)超聲工程研究所提供;RPMI1640培養(yǎng)基?新生小牛血清?PBS平衡液和胰蛋白酶購(gòu)于 Hyclone公司;MTT?二甲亞砜(DMSO)?Fluo-3/AM?Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒和細(xì)胞裂解液購(gòu)于碧云天公司;Bax兔抗人多克隆抗體?Bcl-2兔抗人多克隆抗體和羊抗兔IgG抗血清購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司?

表1 各組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞死亡率(±s,%)

表1 各組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞死亡率(±s,%)

a:P 0.01,與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較;b:P 0.01,與同時(shí)間點(diǎn)低劑量組比較;c:P 0.01,與同時(shí)間點(diǎn)中劑量組比較;d:P0.05,與同組2?24?36?48h時(shí)比較?

組別2h 12h 24h 36h 48h對(duì)照組 1.03±0.98 2.53±1.42 4.36±2.34 5.52±3.45 6.05±2.56低劑量組 35.95±1.16a 61.18±1.54ad 63.24±1.62a 62.77±0.94a 61.81±1.23a中劑量組 47.18±1.03ab 74.76±1.13abd 74.54±1.13ab 74.24±1.24ab 74.88±3.77ab高劑量組 58.35±1.18abc 86.35±1.53abcd 85.76±1.67abc 85.87±1.69abc 85.24±1.68abc

1.2 主要儀器 高強(qiáng)度皮秒脈沖發(fā)生器?電極小室由重慶大學(xué)輸配電裝備及系統(tǒng)安全與新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制;酶標(biāo)儀為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品;激光掃描共聚焦顯微鏡為德國(guó)Leica TCS-SP2公司產(chǎn)品?

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇細(xì)胞,將細(xì)胞置于含10%新生小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,37℃?5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),2～3d傳代1次?

1.3.2 高強(qiáng)度皮秒脈沖電場(chǎng)處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化后離心,PBS液洗滌2～3次,校正細(xì)胞密度至2×106個(gè)/毫升備用?固定場(chǎng)強(qiáng)250kV/cm?重復(fù)頻率3Hz?脈寬800ps,按照脈沖個(gè)數(shù)的不同(0?1 000?3 000和5 000個(gè))分為對(duì)照組及低?中?高劑量組?每組取500μL細(xì)胞懸液置于電極小室,給予相應(yīng)劑量電脈沖,對(duì)照組不予電處理?

1.3.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞死亡率 收集各組細(xì)胞,每組每孔吸取20μL細(xì)胞懸液接種于96孔板,調(diào)零組僅加入培養(yǎng)液而不加細(xì)胞懸液,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,共接種5塊培養(yǎng)板,于37℃?5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2?12?24?36?48h,平板離心機(jī)2 000r/min離心5min?每孔加入MTT溶液20μL,避光培養(yǎng)4h,棄上清液,每孔加DMSO 150μL,振蕩15min,測(cè)定吸光值(A570)?根據(jù)公式:細(xì)胞死亡率(%)=(對(duì)照組A570-實(shí)驗(yàn)組A570)/(對(duì)照組A570-調(diào)零組A570)×100%,計(jì)算出每組細(xì)胞死亡率的平均值?以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次?

1.3.4 激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測(cè)細(xì)胞[Ca2+]i改變 細(xì)胞處理及分組同前?將8mm×8mm蓋玻片置于24孔板中,每孔加入RPMI1640培養(yǎng)液500μL,取各組細(xì)胞各1×106個(gè)種植于蓋玻片上,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔?由MTT結(jié)果可知細(xì)胞在12h死亡率達(dá)到高峰,因此于37℃?5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h?吸去培養(yǎng)液,用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2次,加入5μmol/L Fluo-3/AM 熒光探針,37℃避光孵育60min?PBS洗滌3次?滴加10μL 50%甘油于載玻片上,勾取蓋玻片,將爬有細(xì)胞的一面接觸甘油蓋于載玻片上完成封片?用倒置熒光顯微鏡物鏡觀察,激發(fā)波長(zhǎng)488nm,發(fā)射波長(zhǎng)530nm,按照XYZ三維掃描,掃描密度為1 024×1 024采集熒光圖像?每組隨機(jī)選取8個(gè)單細(xì)胞,用LSCM定量分析軟件測(cè)出各細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度,取平均值?

1.3.5 Western blot法檢測(cè) Bax?Bcl-2蛋白表達(dá) 細(xì)胞處理及分組同前?收集處理后孵育12h的各組細(xì)胞,PBS重懸并計(jì)數(shù),取1×106個(gè)細(xì)胞離心沉淀,用已加PMSF的細(xì)胞裂解液200μL冰浴裂解1h,4℃12 000×g,離心10min,收集上清液,用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度,以40μg蛋白質(zhì)標(biāo)本上樣,經(jīng)12%十二烷基磺酸鈉-聚丙酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì),電轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉37℃封閉1h,加入Bcl-2?Bax一抗4℃過(guò)夜,TBST室溫洗3次,每次10min,加入二抗常溫孵育1h,TBST室溫洗3次,每次10min,凝膠成像系統(tǒng)顯色,檢測(cè)激活型Bcl-2?Bax蛋白水平,以β-actin水平作為等量蛋白上樣對(duì)照?用Quantity One圖像分析軟件分析結(jié)果,印跡條帶吸光度=平均吸光度×面積?Bax/Bcl-2=Bax條帶吸光度/Bcl-2條帶吸光度?

橫在李愫和蕭之間的同樣還有文化而差異，李愫生長(zhǎng)在嘉義農(nóng)村，五個(gè)哥哥目不識(shí)丁，而當(dāng)初李愫考上大學(xué)時(shí)家人認(rèn)為當(dāng)老師對(duì)于這個(gè)農(nóng)民家庭是件光宗耀祖的事情，所以受到了全票支持。李愫的丈夫蕭出生優(yōu)渥，他崇拜美國(guó)文化，幾十年來(lái)一直模仿者美國(guó)的生活方式，他要求李愫打扮成他想要的樣子，而李愫十多年來(lái)究竟還是沒(méi)有學(xué)會(huì)蕭的那套美國(guó)的生活方式，蕭曾經(jīng)甚至稱(chēng)李愫為“農(nóng)業(yè)社會(huì)”的產(chǎn)品，這種自以為是的優(yōu)越使得李愫很不是滋味，李愫“一寸一寸的發(fā)覺(jué)，嫁給一個(gè)人，也同時(shí)嫁給對(duì)方的社會(huì)”③，這就像一個(gè)代表了傳統(tǒng)一個(gè)代表了現(xiàn)代，一個(gè)是東方一個(gè)是西方，這不僅僅是夫妻雙方在生活上的矛盾，更是兩種文化在一場(chǎng)婚姻中的沖撞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至少3次?使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)均用±s表示,MTT結(jié)果進(jìn)行重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析,激光掃描共聚焦及Western blot檢測(cè)采用AVOVA檢驗(yàn)?以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞死亡率 脈沖處理后2?12?24?36?48h各組細(xì)胞的死亡率見(jiàn)表1?相同時(shí)間點(diǎn),處理脈沖個(gè)數(shù)越多,細(xì)胞的死亡率越高,存在明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系;同一處理組細(xì)胞,于處理后12h細(xì)胞死亡率達(dá)到高峰,明顯高于其余各時(shí)間點(diǎn)(P0.01)?

圖1 LSCM透射掃描Hela細(xì)胞檢測(cè)皮秒脈沖對(duì)[Ca2+]i的影響(×200)

2.2 各組細(xì)胞[Ca2+]i檢測(cè)結(jié)果 HeLa細(xì)胞經(jīng) Fluo-3/AM裝載后細(xì)胞質(zhì)呈綠色熒光?低?中?高劑量組掃描視野內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)熒光,與對(duì)照組相比普遍增強(qiáng),個(gè)別細(xì)胞熒光極度增強(qiáng);對(duì)照組細(xì)胞普遍為弱熒光強(qiáng)度,見(jiàn)圖1?各組隨機(jī)采集8個(gè)結(jié)構(gòu)清晰?胞膜完整的單HeLa細(xì)胞,測(cè)定其熒光強(qiáng)度并行半定量分析,低?中?高劑量組細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為58.40±4.80?75.89±8.93和101.72±9.62,均明顯高于對(duì)照組(39.14±5.97,P0.01)?

2.3 Bax?Bcl-2蛋白表達(dá)結(jié)果 對(duì)照組中Bax表達(dá)量較低,經(jīng)皮秒脈沖處理后,其表達(dá)量升高,且脈沖劑量越大,表達(dá)越強(qiáng);抗凋亡蛋白Bcl-2在各處理組表達(dá)較對(duì)照組有所減弱(P0.01);Bax/Bcl-2比例上調(diào),促凋亡作用明顯,且高劑量組Bax/Bcl-2比例上調(diào)現(xiàn)象最為明顯,其誘導(dǎo)凋亡的作用最強(qiáng),見(jiàn)圖2?3?

圖2 Western blot法檢測(cè)Bax?Bcl-2表達(dá)的結(jié)果

圖3 各組細(xì)胞Bax/Bcl-2平均光密度值

3 討 論

宮頸癌的發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首,目前主要采取手術(shù)結(jié)合放?化療的綜合治療方案?傳統(tǒng)治療在治病的同時(shí)往往會(huì)對(duì)生殖器官造成嚴(yán)重?fù)p害,影響性功能及生育能力?隨著近年來(lái)宮頸癌發(fā)病年輕化及患者對(duì)生活質(zhì)量要求的不斷提高[11],尋求一種既能有效殺滅腫瘤細(xì)胞又能保持生殖系統(tǒng)完整性的無(wú)創(chuàng)治療手段,是醫(yī)患雙方的共同期待?高強(qiáng)度皮秒脈沖電場(chǎng)因其高場(chǎng)強(qiáng)?低脈寬的物理學(xué)特性,具有集中性好?激發(fā)能量高?超寬帶頻譜豐富?方向性精確?控制性良好等優(yōu)勢(shì),成為無(wú)創(chuàng)治療研究的良好選擇?

目前,國(guó)內(nèi)外有關(guān)高強(qiáng)度皮秒脈沖生物電效應(yīng)機(jī)制的研究甚少,僅有兩篇有關(guān)皮秒脈沖實(shí)驗(yàn)研究的報(bào)道,證實(shí)了皮秒脈沖對(duì)腫瘤細(xì)胞的損傷效應(yīng)是熱效應(yīng)和電效應(yīng)的聯(lián)合作用,但并未進(jìn)行相關(guān)機(jī)制探討[12]?與上述研究不同,本研究一方面通過(guò)降低皮秒脈沖參數(shù)劑量以避免熱效應(yīng),同時(shí)進(jìn)行相關(guān)機(jī)制探討,用不同實(shí)驗(yàn)方法探討皮秒脈沖電場(chǎng)對(duì)HeLa細(xì)胞的損傷效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制?

MTT比色法顯示經(jīng)高強(qiáng)度皮秒脈沖作用后HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度抑制,且存在明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系?已知細(xì)胞死亡可表現(xiàn)為壞死和凋亡,其中壞死即刻發(fā)生,而凋亡需要時(shí)間來(lái)完成?因此,處理后2h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制可能由細(xì)胞壞死造成,而處理后12h細(xì)胞抑制率增高,則說(shuō)明細(xì)胞可能發(fā)生了凋亡?為了研究高強(qiáng)度皮秒脈沖能否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,本研究同時(shí)進(jìn)行了細(xì)胞[Ca2+]i和 Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)?

激光掃描共聚焦示皮秒脈沖處理組細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組,提示皮秒脈沖可導(dǎo)致細(xì)胞[Ca2+]i升高?已知哺乳動(dòng)物細(xì)胞核膜與細(xì)胞膜的充電時(shí)間常數(shù)分別為幾十納秒(ns)和幾百納秒,而細(xì)胞器的充電時(shí)間常數(shù)僅為幾百皮秒(ps)[13]?高強(qiáng)度皮秒脈沖電場(chǎng)具有極高的場(chǎng)強(qiáng)?極窄的脈寬(ps級(jí)),當(dāng)作用于細(xì)胞時(shí),不滿足細(xì)胞膜電穿孔所需的充電時(shí)間,對(duì)細(xì)胞膜無(wú)損傷,而胞內(nèi)細(xì)胞器(如線粒體?內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)因充電速度極快,可先于細(xì)胞膜與核膜受到影響[14],故可以排除[Ca2+]i升高是由于細(xì)胞膜不完整情況下胞外Ca2+內(nèi)流所致,而可能來(lái)自于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)?線粒體等胞內(nèi)Ca2+庫(kù)的釋放?Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使,已有大量研究證實(shí)[Ca2+]i升高參與了凋亡早期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡的執(zhí)行階段?線粒體跨膜電位(ΔΨm)的崩解,[Ca2+]i升高,使許多與細(xì)胞凋亡直接相關(guān)的酶或蛋白質(zhì)被釋放到胞質(zhì)中,就可能通過(guò)破壞核內(nèi)染色質(zhì)?激活Caspase或作用于其他Ca2+依賴(lài)性蛋白質(zhì)引起細(xì)胞凋亡?本實(shí)驗(yàn)中處理組細(xì)胞[Ca2+]i升高,很可能進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?

Bcl-2基因家族及其相關(guān)蛋白Bcl-2是研究最早的與凋亡有關(guān)的基因,也是目前最受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族?Bcl-2是細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)因子,Bax能拮抗Bcl-2,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡?因此,細(xì)胞中Bax/Bcl-2比例可以反映細(xì)胞的死亡調(diào)控狀態(tài)?本實(shí)驗(yàn)中處理組細(xì)胞Bax/Bcl-2比例上調(diào),且高劑量組最為明顯,說(shuō)明高強(qiáng)度皮秒脈沖電場(chǎng)能影響細(xì)胞的生存狀態(tài),促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Bax高表達(dá),從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生?

高強(qiáng)度皮秒脈沖電場(chǎng)因其獨(dú)特的物理學(xué)特性,有望成為繼熱療?磁療?高強(qiáng)度聚焦超聲等療法之后又一種新穎?無(wú)創(chuàng)?有效的腫瘤物理治療手段?目前國(guó)外對(duì)皮秒脈沖電場(chǎng)的生物學(xué)效應(yīng)研究甚少,本課題組在國(guó)內(nèi)首次對(duì)皮秒脈沖電場(chǎng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物電學(xué)效應(yīng)進(jìn)行研究,旨在為基于靶向誘導(dǎo)凋亡的高強(qiáng)度皮秒脈沖無(wú)創(chuàng)治療技術(shù)提供研究基礎(chǔ),其有效實(shí)驗(yàn)參數(shù)的篩選?細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的探討?動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中皮秒天線的輻射及聚焦等諸多領(lǐng)域有待進(jìn)一步研究解決?

[1]JoséA,Sobrevals L,Ivorra A,et al.Irreversible electroporation shows efficacy against pancreatic carcinoma without systemic toxicity in mouse models[J].Cancer Lett,2012,317(1):16-23.

[2] Shankayi Z,Firoozabadi SM.Tumor growth inhibited by low-voltage amplitude and 5-kHz frequency electrochemotherapy[J].J Membr Biol,2011,244(3):121-128.

[3] Cemazar M,Jarm T,SersaG.Cancer electrogenetherapy with interleukin-12[J].Curr Gene Ther,2010,10(4):300-311.

[4] Neal RE,Davalos RV.The feasibility of irreversible electroporation for the treatment of breast cancer and other heterogeneous systems[J].Ann Biomed Eng,2009,37(12):2615-2625.

[5] Heller LC,Heller R.Electroporation gene therapy preclinical and clinical trials for melanoma[J].Curr Gene T-her,2010,10(4):312-317.

[6] Horton HM,Lalor PA,Rolland AP.IL-2plasmid electroporation:from preclinical studies to phaseⅠclinical trial[J].Methods Mol Biol,2008,423:361-372.

[7] Schoenbach KH,Hargrave B,Joshi RP,et al.Bioelectric effects of intense nanosecond pulses[J].IEEE Trans Dielectr Electr Insul,2007,14(5):1088-1107.

[8] Yao C,Mi Y,Li CX,et al.Study of transmembrane potentials on cellular inner and outer membrane-Frequency response model and its filter characteristic simulation[J].IEEE Trans Biomed Eng,2008,55(7):1792-1799.

[9] Schoenbach KH,Beebe SJ,Buescher ES.Intracellular effect of ultrashort electrical pulses[J].Bioelectromagnetics,2001,22(6):440-448.

[10]Beebe SJ,Fox PM,Rec LJ,et al.Nanosecond,high-intensity pulsed electric fields induce apoptosis in human cells[J].FASEB J,2003,17(11):1493-1495.

[11]Bray F,Loos AH,Mccarron P,et al.Trends in cervical squamous cell carcinoma incidence in 13European countries:changing risk and the effects of screening[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2005,14(3):677-686.

[12]Schoenbach KH,Shu X,Ravindra P,et al.The effect of intense subnanosecond electrical pulses on biological cells[J].IEEE Trans Plasma Sci,2008,36(2):414-422.

[13]Yao C,Mo DB,Li CX,et al.Study of transmembrane potentials of inner and outer membranes induced by pulsedelectric-field model and simulation[J].IEEE Trans Plasma Sci,2007,35(5):1541-1549.

[14]龍?jiān)偃?姚陳果,孫才新,等.ps電場(chǎng)脈沖無(wú)創(chuàng)治療腫瘤的方法及天線設(shè)計(jì)[J].高電壓技術(shù),2010,36(5):1275-1280.

In vitro study of damaging effects of intense picosecond pulsed electric field on HeLa cells*

, ,,,
(1.,,,400010,;2.,,400030,)

ObjectiveTo investigate the damaging effect and mechanism of intense picosecond pulsed electric field(psPEF)on HeLa cells in vitro.MethodsIntense psPEF with constant parameters(pulse duration of 800ps,repetition frequency of 3Hz,and electric intensity of 250kV/cm)and different pulses(0,1 000,3 000and 5 000)were performed on HeLa cells.MTT assay was used to trace the effect of growth inhibition at different times.The changes of[Ca2+]i in HeLa cells were observed by laser scanning confocal microscope using Fluo-3/AM as the calcium fluorescent indicator.Western blot was used to measure the changes of expression level of Bcl-2and Bax.ResultsThe mortality rate of HeLa cells elevated with increasing of the amount of pulses,and the maximum inhibitory rate was observed 12hafter the treatment.Compare with the control group,[Ca2+]i was markedly increased by treatment with psPEF (P0.05).By increasing the pulse number,the expression of Bax was increased from 0.205±0.102in control group to 0.257±0.083,0.586±0.138and 0.791±0.262in treated groups(P0.05),and Bcl-2was decreased from 0.694±0.132in control group to 0.591±0.145,0.364±0.105and 0.262±0.092in treated groups(P0.05),demonstrating significant increase of Bax/Bcl-2ratio in all treated groups(P0.05).ConclusionIntense psPEF can damage the HeLa cells as well as inducing tumor cell apoptosis.

electromagnetic fields;pulse therapy;apoptosis;tumor cells,cultured

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.001

A

1671-8348(2012)18-1785-03

* 基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81172123,50877083)?△

,Tel:13908359484;E-mail:xiongzhengai61@21cn.com?

2011-12-19

2012-02-22)

?論 著?