嚴之紅 郭威早 佟 倩

(航天中心醫(yī)院高干二科，北京 100049)

缺血再灌注(IR)損傷是腦血管疾病組織損害中核心病理因素之一〔1〕。研究顯示，細胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號通路在IR損傷的修復機制中具有重要作用〔2〕，而腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)對神經(jīng)損傷的保護作用亦獲得了明確的實驗依據(jù)，并且這種保護作用的分子機制與ERK信號通路關(guān)系密切〔3〕。然而，BDNF和ERK信號通路在IR損傷中的關(guān)系目前尚不明確。本文旨在研究BDNF在IR損傷中的神經(jīng)保護作用及其與ERK信號傳導的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 IR損傷動物模型 體重250 g左右的健康雄性SD大鼠被隨機分為A、B、C三組，每組6只，所有的大鼠均經(jīng)歷腦局灶性缺血再灌注過程。MCAO缺血再灌注參考文獻〔4〕報道并作適度改良，具體操作方法:以10%(w/v)水合氯醛按400 mg/kg的劑量經(jīng)腹腔注射對大鼠實施麻醉。在大鼠頸部中線由下頜至胸骨實施切口，將頸部肌肉向旁剝離以便暴露頸總動脈。將Dermalon 3-0號單纖維手術(shù)縫線末端用熾熱前狀態(tài)的金屬片烙約1 s，使末端鈍化，然后在距末端20 mm處標記。雙側(cè)頸總動脈以微型血管夾斷流，在右側(cè)頸內(nèi)動脈和頸總動脈的分叉附近切口，將端頭鈍化處理的手術(shù)線插入，沿頸內(nèi)動脈上行約20 mm，遇阻力后即停止。腦缺血狀態(tài)持續(xù)45 min，然后將微型血管夾和手術(shù)縫線撤除，使再灌注保持12 h。

1.2 BDNF的應用及ERK信號通路的阻斷 冷凍干燥的BDNF蛋白結(jié)晶和選擇性Raf-1抑制劑均由美國國立精神衛(wèi)生研究所生物標記實驗室贈送。將BDNF溶于pH7.4磷酸鹽緩沖液配成1μg/μl的溶液備用。將Bay 43-9006溶于二甲基亞砜(DMSO)配成5 ng/μl的溶液備用。A組大鼠在進入IR之前6 h，在每只大鼠的右腦室注射2μl pH7.4磷酸鹽緩沖液;B、C兩組大鼠在進入IR之前6 h，在每只大鼠的右腦室注射2.0μg BDNF。A、B兩組大鼠在進入IR之前12 h，在每只大鼠的右腦室注射2μl DMSO，C組大鼠在進入IR之前12 h，在每只大鼠的右腦室注射10 ng Bay 43-9006。

1.3 腦損傷的組織化學評估 對每個大鼠按常規(guī)步驟開顱及分離腦，切除嗅球及少量頂端前額葉組織，然后切取額葉，固定48 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，每隔1 mm行額狀切片并進行編號。切片經(jīng)常規(guī)甲酚紫染色和顯微拍照后，采用Image-Pro Plus(Media Cybernetics，v6)圖像分析確定和比較腦損傷的面積〔5〕進行。腦損傷的程度以組織損失的百分比表示。

1.4 蛋白免疫印跡雜交 根據(jù)本課題組既往報道〔6〕的方法進行，針對組織特點進行了適應性改變。將約100 mg腦組織浸入1 ml冰冷的裂解緩沖液，勻漿后通過Virtis超聲細胞粉碎儀進行超聲剪切(設置2.0，處理1 s×10次)，然后離心5 min去除不溶性沉渣。蛋白濃度測定采用Pierce公司BCA蛋白試劑盒進行。等量的蛋白加入到8% ～16%SDS-PAGE進行電泳分離，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜上的非特異結(jié)合通過以下雜交液屏蔽。雜交液包括Tris緩沖鹽水，0.1%吐溫-20，5%脫脂牛奶。ERK抗體(抗 ERK 1/2，即抗 p44/p42)，磷酸化ERK抗體(抗202位蘇氨酸磷酸化的ERK 1/2)購自Santa Cruz生物技術(shù)公司，實驗中采用1∶500的比例稀釋。次級抗體為辣根過氧化物酶耦聯(lián)的抗山羊(運用于ERK1/2)或抗兔(運用于pERK1/2)抗體。免疫復合物用Amersham ECL加強型試劑盒探測。免疫印跡的定量分析采用Syngene凝膠建檔及分析系統(tǒng)進行。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5軟件進行ANOVA，Tukey Post-Hoc及t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 BDNF對于IR損傷具有明顯的保護作用 在單純IR損傷組(A組)，腦組織損傷面為(16.48±5.72)%;在使用BDNF預處理的情況下(B組)，腦組織損傷面為(6.32±3.08)%，較A組顯著減少 (P=0.039);與未使用BDNF的A組比較，損傷面積減少到原來的38.3%。然而，在使用BDNF的同時使用選擇性Raf-1抑制劑(C組)，則BDNF的神經(jīng)保護作用被明顯稀釋，腦組織損傷面積又回升到(11.40±3.28)%，與A組已經(jīng)不構(gòu)成顯著差別。

2.2 Bay 43-9006抑制ERK通路的活性水平 B組和C組使用了相同劑量的BDNF預治療，但C組同時使用了選擇性Raf-1抑制劑Bay 43-9006。因為Raf-1是ERK信號通路中的重要信號分子，因此，以磷酸化水平所代表的ERK信號傳導活性水平顯著降低。ERK1(p44)的磷酸化水平由B組的(51.73±13.06)%下降至C組的(25.34±12.12)%，具有高顯著性差異(P=0.008 4)。ERK2(p42)的磷酸化水平由B組的(81.16±17.03)%下降至C組的(50.42±14.56)%，差異亦具有顯著性(P=0.029)。

3 討論

因既往研究顯示BDNF的神經(jīng)保護作用經(jīng)由ERK信號傳導通路介導〔7〕，因此在本文觀察到BDNF對IR損傷的保護作用之后，在機制方面聚焦到ERK信號傳導。與筆者的理論預計一致，當ERK信號通路上的Raf-1這一關(guān)鍵信號分子被Bay 43-9006選擇性抑制后，BDNF的神經(jīng)保護作用也被顯著抵消。綜合以上觀察結(jié)果，筆者推論，在腦IR過程中，ERK信號傳導介導了BDNF的神經(jīng)保護。但這一推論仍然只能作為一個具有局限性的初步結(jié)論，是一個深入研究的起點。Bay 43-9006的生物學活性并非僅限于Raf-1信號分子的抑制〔8〕，因此目前的研究結(jié)果需要謹慎解釋。

IR損傷的病理機制廣泛而復雜，在分子病理水平上尤其如此，這其中涉及多個信號傳導通路、細胞因子和神經(jīng)遞質(zhì)等〔9〕。在腦IR損傷中，ERK的激活具有促進DNA修復、抑制細胞凋亡、保護神經(jīng)元的作用〔10〕，具有潛在的臨床運用價值。其實，對ERK通路的調(diào)節(jié)不僅有BDNF，還有其他很多的分子、受體、細胞因子、激素等，甚至一些心血管藥物也同樣具有ERK的調(diào)節(jié)作用〔11〕。積極利用這些調(diào)節(jié)途徑，促進IR損傷的修復和相應疾病的預后，會對治療諸如缺血性腦中風等心腦血管疾病具有積極的促進作用。

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