李衛(wèi)萍 趙正保

山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西太原 030001

通過體外培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，加入脂多糖后通過MTT（噻唑藍(lán)）法測定細(xì)胞存活率[1-4]，研究脂多糖對細(xì)胞的影響。MTT比色法[2-3]，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光密度值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。本課題旨在通過MTT分析法探討脂多糖對RAW264.7細(xì)胞生長的影響。

12 資料與方法

1.1 一般資料

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株；受試藥物：脂多糖；試劑：DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司）500mL裝；胰蛋白酶-EDTA消化液 （solarbio公司）100mL裝；無支原體胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）100mL裝；青鏈霉素混合液（solarbio公司）100×；MTT（噻唑藍(lán)）（solarbio 公司）1g 裝；二甲基亞砜(DMSO)（購自天津市化學(xué)試劑一廠）500mL裝。

1.2 儀器

立壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；HF SuperPW系列超純水系統(tǒng)（上?？道追治鰞x器有限公司）；KDC-40型低速離心機(jī) （長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；311二氧化碳培養(yǎng)箱 （上海力申科學(xué)儀器有限公司）；BJ-2CD型潔凈工作臺（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；DMIL生物顯微鏡（德國徠卡公司）；ELX-800酶標(biāo)儀 （美國寶特公司）；WD-9405B型水平搖床。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞）細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d換液1次。

1.3.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞的密度，使細(xì)胞分布均勻，以每孔100μL接種于96孔板，分別設(shè)調(diào)零組、對照組和實(shí)驗組，調(diào)零孔不加細(xì)胞?？装宓乃闹芸拙覲BS緩沖液100μL。待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗組加濃度為 0.5、1、2、5、10 μg/mLLPS，于 37℃、5﹪二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48。對照組加入等量的藥物溶解介質(zhì)，每個藥物濃度設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)時間結(jié)束后取出培養(yǎng)板，各孔均加入MTT20μL，于37℃、5%二氧化碳繼續(xù)孵育4h；取出孔板，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜 （DMSO），置于水平搖床上低速震蕩10min，全自動酶標(biāo)儀在490nm處測定吸光度OD值。

按以下公式計算細(xì)胞抑制率：

4 結(jié)果（表1）

表1 LPS在不同給藥時間與RAW264.7細(xì)胞抑制率

LPS 在 0.5、1、2、5、10 μg/mL 時，濃度依賴性地抑制RAW264.7細(xì)胞的生長。

3 討論

MTT方法測定結(jié)果顯示，LPS對RAW264.7細(xì)胞的抑制作用表現(xiàn)為隨劑量的增加而抑制率增加，隨著作用時間的延長而抑制率增加，這些充分說明LPS能夠抑制RAW264.7的生長。

[1]王軼楠，柳忠輝，馮野，等.脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264[J].7細(xì)胞的活化調(diào)亡作用,2009,2(22):436-438.

[2]趙文昌，宋麗軍.NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在治療炎癥性腸炎中的作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2010,21(7):1792-1794.

[3]丁輝,錢家鳴.5-氨基水楊酸治療潰瘍性結(jié)腸炎的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析，2008,8(9):714-716.

[4]曲云東,林森.氨基水楊酸類藥物治療炎癥性腸病的應(yīng)用進(jìn)展[J].世界臨床藥物，2008,29(12):727-730.