劉琳娜,戚志華,郭志偉,張 琰,張海鳳,張文娟
小柴胡湯由柴胡、黃芩、黨參、甘草(炙)、生姜、大棗和半夏7味藥材組成,具有疏肝利膽、通利三焦水道的作用,用于治療慢性肝炎、肝硬化伴腹水[1]。為提高小柴胡湯的生物利用度,加快藥物溶出速率,筆者經(jīng)過精制、富集其有效成分,將其制成滴丸劑[2],為有效控制該制劑的質(zhì)量,本實驗選取組方中的黃芩和柴胡以薄層色譜檢查作為定性指標(biāo),選取黃芩中的黃芩苷作為定量指標(biāo),應(yīng)用HPLC法測定其含量。
日本島津高效液相色譜儀(LC-10ATvp泵,SPD-Avp紫外檢測器,Class-10 Avp色譜工作站); BP211D型電子天平(1/10萬,北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);密理博Millipore高純水機(美國密理博公司)。
小柴胡湯滴丸(自制);黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供,供含量測定用);薄層色譜用硅膠G(青島海洋化工廠產(chǎn)品);甲醇為色譜純(fisher公司),其他試劑均為分析純,水為超純水。
2.1 薄層鑒別
2.1.1 柴胡 ①供試品溶液的制備:取本品約3 g,于研缽中研細,加甲醇30 mL,加熱回流1 h,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇1 mL溶解;②對照藥材溶液的制備:取柴胡對照藥材約0.5 g,加甲醇20 mL,自“加熱回流1 h”起制備對照藥材溶液;③缺柴胡陰性對照溶液的制備:取缺柴胡陰性樣品約3 g,制備方法同①。按照《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B[3]進行實驗,吸取上述3種溶液各5 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,展開劑為乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1),展距約8 cm,展開后取出,晾干,噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液,在105℃加熱至斑點顯色清晰,置365 nm紫外光燈下檢視。供試品與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上均顯示相同的藍色熒光斑點,陰性對照無斑點。見圖1。
2.1.2 黃芩 ①供試品溶液的制備:取本品約3 g,于研缽中研細,加丙酮 30 mL,加熱回流40 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加丙酮1 mL使溶解;②對照藥材溶液的制備:取黃芩對照藥材0.5 g,同①制備對照品溶液;③缺黃芩陰性對照溶液的制備:另稱取與供試品處方相同比例,但無黃芩的處方藥味的陰性對照樣品3 g,按供試品溶液制備的方法制成對照藥材溶液,按照《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B[3]進行實驗,吸取上述3種溶液各5 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,展開劑為乙酸丁酯-甲酸-水(70∶25∶25),展距約8 cm,展開后取出,晾干,噴以2%三氯化鐵乙醇液,日光燈下檢視,供試品和黃芩對照藥材在相應(yīng)位置上顯顏色相同的斑點,陰性對照無斑點。見圖2。
圖1 柴胡的TLC圖注:從左到右依次為供試品(第1批),供試品(第2批),供試品(第3批),柴胡對照藥材,缺柴胡陰性對照
圖2 黃芩的TLC圖注:1.供試品(第1批);2.供試品(第2批);3.供試品(第3批); 4.黃芩對照藥材;5.缺黃芩陰性對照
2.2 黃芩苷含量測定
2.2.1 色譜條件 采用日本島津高效液相色譜儀(LC-10ATvp泵,SPD-Avp紫外檢測器,Class-10 Avp色譜工作站)建立小柴胡湯滴丸中主要成分黃芩苷的 HPLC檢測條件:Hypemil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液(45∶55)[3],檢測波長為280 nm,流速1.0 mL/min,柱溫30℃,進樣量10 μL,理論塔板數(shù)按黃芩苷計不應(yīng)低于3 000。黃芩苷的色譜圖見圖3。
2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取在60℃減壓干燥4 h的黃芩苷對照品20 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度。精密吸取上述溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL,分別置20 mL量瓶中,配成各個濃度的黃芩苷對照品溶液,備用。
2.2.3 供試品溶液的配制 取小柴胡湯滴丸80粒,精密稱定,于研缽中研細,精密稱定0.5 g,放入具塞錐形瓶中,加70%乙醇50 mL,超聲處理30 min,過濾,取濾液0.45 μm濾膜過濾,即得。
2.2.4 陰性對照溶液的制備 取不含黃芩、其他成分不變的滴丸80粒,按“2.2.3”項下制備,即得。
2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取“2.2.2”項下各濃度的黃芩苷對照品溶液10 μL進樣進行測定,以進樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),得其回歸方程為Y=1 124 508 X-5 549.66(r=0.999 7)。結(jié)果表明,黃芩苷在0.1~1.2 μg內(nèi),進樣量與峰面積具有良好的線性關(guān)系。
2.2.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液2 μL,連續(xù)進樣6次,測定色譜峰面積,計算RSD值。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為0.89%,表明儀器的精密度良好。
圖3 小柴胡湯滴丸中主要成分黃芩苷的HPLC圖注:A.對照品,B.樣品,C.陰性;1.黃芩苷
2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液,分別于0、2、4、8、10、12 h進樣2 μL,共6次,測定色譜峰面積,計算RSD值。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為1.08%,表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取同批次已知含量的滴丸樣品6份,于研缽中研細,按照“表1”中所示量分別精密加入黃芩苷,按“2.2.3”項下制備,進樣量2 μL,按照“2.2.4”項下色譜條件測定,計算黃芩苷的平均回收率及RSD值,結(jié)果見表1。
表1 黃芩苷加樣回收率試驗(n=6)
2.2.9 樣品含量測定 按照“2.2.1”項下所示的樣品溶液制備方法,制備3批次小柴胡湯滴丸樣品溶液,平行測定其中黃芩苷的含量。結(jié)果:批號分別為20100513、20100519和20100529的小柴胡湯滴丸樣品中的黃芩苷含量分別為26.3、26.8、27.2 mg/g,RSD分別為1.08%、0.97%、0.90%。
本制劑為中藥復(fù)方制劑,由多味藥材提取制成,本實驗分別從定性和定量兩個方面對制劑質(zhì)量進行控制,采用薄層色譜法對方中黃芩和柴胡進行了定性鑒別,同時進行了陰性對照試驗,該方法簡便且具有較強的專屬性;采用HPLC對方中黃芩的黃芩苷進行了定量測定,結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性良好,能夠良好地控制制劑的質(zhì)量。
考慮到本制劑組方藥材較多,故采取了超聲和回流兩種方法對黃芩中黃芩苷的提取率進行了比較,結(jié)果表明,兩種方法對黃芩苷的提取率相差無幾,但超聲提取方法操作相對簡便,故在樣品處理方法上確定為超聲提取30 min。
小柴胡湯滴丸為復(fù)方制劑,成分復(fù)雜,干擾較大,本實驗建立了處方中柴胡與黃芩兩味中藥的TLC鑒別,便于該制劑的快速質(zhì)量控制;HPLC測定小柴胡湯滴丸的有效成分黃芩苷的含量為26.8 mg/g,考慮到生產(chǎn)過程中的損失,故確定本制劑中黃芩苷含量應(yīng)不低于23.0 mg/g。
[1] 柴瑞霞.《傷寒論》小柴胡湯證治研究[J].中醫(yī)藥通報,2010,9(1):8.
[2] 劉琳娜,張琰,徐媛,等.正交試驗法優(yōu)選小柴胡湯滴丸制備工藝[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(9):44.
[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄ⅥB.