劉琳娜，戚志華，郭志偉，張 琰，張海鳳，張文娟

小柴胡湯由柴胡、黃芩、黨參、甘草(炙)、生姜、大棗和半夏7味藥材組成，具有疏肝利膽、通利三焦水道的作用，用于治療慢性肝炎、肝硬化伴腹水［1］。為提高小柴胡湯的生物利用度，加快藥物溶出速率，筆者經(jīng)過精制、富集其有效成分，將其制成滴丸劑［2］，為有效控制該制劑的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)選取組方中的黃芩和柴胡以薄層色譜檢查作為定性指標(biāo)，選取黃芩中的黃芩苷作為定量指標(biāo)，應(yīng)用HPLC法測定其含量。

1 儀器與材料

日本島津高效液相色譜儀(LC-10ATvp泵，SPD-Avp紫外檢測器，Class-10 Avp色譜工作站); BP211D型電子天平(1/10萬，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);密理博Millipore高純水機(jī)(美國密理博公司)。

小柴胡湯滴丸(自制);黃芩苷對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用);薄層色譜用硅膠G(青島海洋化工廠產(chǎn)品);甲醇為色譜純(fisher公司)，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 柴胡 ①供試品溶液的制備:取本品約3 g，于研缽中研細(xì)，加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解;②對(duì)照藥材溶液的制備:取柴胡對(duì)照藥材約0.5 g，加甲醇20 mL，自“加熱回流1 h”起制備對(duì)照藥材溶液;③缺柴胡陰性對(duì)照溶液的制備:取缺柴胡陰性樣品約3 g，制備方法同①。按照《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B［3］進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開劑為乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)，展距約8 cm，展開后取出，晾干，噴以2%對(duì)二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置365 nm紫外光燈下檢視。供試品與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上均顯示相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無斑點(diǎn)。見圖1。

2.1.2 黃芩 ①供試品溶液的制備:取本品約3 g，于研缽中研細(xì)，加丙酮 30 mL，加熱回流40 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)颖? mL使溶解;②對(duì)照藥材溶液的制備:取黃芩對(duì)照藥材0.5 g，同①制備對(duì)照品溶液;③缺黃芩陰性對(duì)照溶液的制備:另稱取與供試品處方相同比例，但無黃芩的處方藥味的陰性對(duì)照樣品3 g，按供試品溶液制備的方法制成對(duì)照藥材溶液，按照《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B［3］進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開劑為乙酸丁酯-甲酸-水(70∶25∶25)，展距約8 cm，展開后取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇液，日光燈下檢視，供試品和黃芩對(duì)照藥材在相應(yīng)位置上顯顏色相同的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無斑點(diǎn)。見圖2。

圖1 柴胡的TLC圖注:從左到右依次為供試品(第1批)，供試品(第2批)，供試品(第3批)，柴胡對(duì)照藥材，缺柴胡陰性對(duì)照

圖2 黃芩的TLC圖注:1.供試品(第1批);2.供試品(第2批);3.供試品(第3批); 4.黃芩對(duì)照藥材;5.缺黃芩陰性對(duì)照

2.2 黃芩苷含量測定

2.2.1 色譜條件 采用日本島津高效液相色譜儀(LC-10ATvp泵，SPD-Avp紫外檢測器，Class-10 Avp色譜工作站)建立小柴胡湯滴丸中主要成分黃芩苷的 HPLC檢測條件:Hypemil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸溶液(45∶55)［3］，檢測波長為280 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，理論塔板數(shù)按黃芩苷計(jì)不應(yīng)低于3 000。黃芩苷的色譜圖見圖3。

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取在60℃減壓干燥4 h的黃芩苷對(duì)照品20 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。精密吸取上述溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL，分別置20 mL量瓶中，配成各個(gè)濃度的黃芩苷對(duì)照品溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的配制 取小柴胡湯滴丸80粒，精密稱定，于研缽中研細(xì)，精密稱定0.5 g，放入具塞錐形瓶中，加70%乙醇50 mL，超聲處理30 min，過濾，取濾液0.45 μm濾膜過濾，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取不含黃芩、其他成分不變的滴丸80粒，按“2.2.3”項(xiàng)下制備，即得。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取“2.2.2”項(xiàng)下各濃度的黃芩苷對(duì)照品溶液10 μL進(jìn)樣進(jìn)行測定，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得其回歸方程為Y=1 124 508 X-5 549.66(r=0.999 7)。結(jié)果表明，黃芩苷在0.1～1.2 μg內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液2 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定色譜峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為0.89%，表明儀器的精密度良好。

圖3 小柴胡湯滴丸中主要成分黃芩苷的HPLC圖注:A.對(duì)照品，B.樣品，C.陰性;1.黃芩苷

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、10、12 h進(jìn)樣2 μL，共6次，測定色譜峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為1.08%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同批次已知含量的滴丸樣品6份，于研缽中研細(xì)，按照“表1”中所示量分別精密加入黃芩苷，按“2.2.3”項(xiàng)下制備，進(jìn)樣量2 μL，按照“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算黃芩苷的平均回收率及RSD值，結(jié)果見表1。

表1 黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)(n=6)

2.2.9 樣品含量測定 按照“2.2.1”項(xiàng)下所示的樣品溶液制備方法，制備3批次小柴胡湯滴丸樣品溶液，平行測定其中黃芩苷的含量。結(jié)果:批號(hào)分別為20100513、20100519和20100529的小柴胡湯滴丸樣品中的黃芩苷含量分別為26.3、26.8、27.2 mg/g，RSD分別為1.08%、0.97%、0.90%。

3 討論

本制劑為中藥復(fù)方制劑，由多味藥材提取制成，本實(shí)驗(yàn)分別從定性和定量兩個(gè)方面對(duì)制劑質(zhì)量進(jìn)行控制，采用薄層色譜法對(duì)方中黃芩和柴胡進(jìn)行了定性鑒別，同時(shí)進(jìn)行了陰性對(duì)照試驗(yàn)，該方法簡便且具有較強(qiáng)的專屬性;采用HPLC對(duì)方中黃芩的黃芩苷進(jìn)行了定量測定，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性良好，能夠良好地控制制劑的質(zhì)量。

考慮到本制劑組方藥材較多，故采取了超聲和回流兩種方法對(duì)黃芩中黃芩苷的提取率進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，兩種方法對(duì)黃芩苷的提取率相差無幾，但超聲提取方法操作相對(duì)簡便，故在樣品處理方法上確定為超聲提取30 min。

小柴胡湯滴丸為復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，干擾較大，本實(shí)驗(yàn)建立了處方中柴胡與黃芩兩味中藥的TLC鑒別，便于該制劑的快速質(zhì)量控制;HPLC測定小柴胡湯滴丸的有效成分黃芩苷的含量為26.8 mg/g，考慮到生產(chǎn)過程中的損失，故確定本制劑中黃芩苷含量應(yīng)不低于23.0 mg/g。

［1］ 柴瑞霞.《傷寒論》小柴胡湯證治研究［J］.中醫(yī)藥通報(bào)，2010，9(1):8.

［2］ 劉琳娜，張琰，徐媛，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選小柴胡湯滴丸制備工藝［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(9):44.

［3］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅥB.