郭 哲，高興華，夏立新，王雅坤，馬麗娟，何春滌，陳洪鐸

肝臟在體內(nèi)平衡被破壞時，會合成一組急性期蛋白，其作用是參與宿主對感染及損傷組織修復(fù)中的防御，進而保持體內(nèi)平衡［1］。結(jié)合珠蛋白(Hp)是急性期蛋白之一，在肺、肝、腎上腺、脂肪組織、輸尿管、附睪、卵巢、頜下腺、皮膚中均有表達［2-3］。正常小鼠的Hp mRNA表達于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和毛囊上皮細(xì)胞中［4］。Hp有抗氧化、抗炎作用［5-7］，對淋巴細(xì)胞功能有很強的免疫抑制作用。Xie等［8］發(fā)現(xiàn)，Hp通過阻止朗格漢斯細(xì)胞功能轉(zhuǎn)換和激活T細(xì)胞來干預(yù)朗格漢斯細(xì)胞，起到抑制朗格漢斯細(xì)胞功能的作用。Arredouani等［9］發(fā)現(xiàn)，接觸性皮炎血中Hp濃度升高。本文觀察甘草甜素處理后的接觸性皮炎小鼠皮膚中的Hp表達改變，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 實驗動物 BALB/c小鼠126只，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供。均為SPF級雌性，6～8周，體質(zhì)量(20±2)g。

1.2 實驗儀器 pH計(美國 Queue SystemsTM2711型);解剖顯微鏡(南匯光學(xué)儀器廠);電熱恒溫水箱(河北黃驊航天儀器廠，TDW-2002型);電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器公司，DH3600A型);光學(xué)顯微鏡(日本Olympus);深低溫冰箱(日本SANYO，Altra Low);紫外分光光度計(美國Spectronic GeneSys TM 2711型);電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-Ⅲ2型);電泳槽(北京六一儀器廠，DYY-Ⅲ2型);全能型高性能臺式冷凍離心機(德國Heaeus，Biofuge Stratos);組織勻漿機(德國Heidohp，Diax 900型);PCR擴增儀(德國Biometra，T-Gradient);紫外凝膠成像系統(tǒng)(英國 Gel workers eD，UVP GDS8000)。

1.3 主要試劑 甘草甜素(GL，商品名:美能，日本美能發(fā)源制藥公司。2 mL/支，含GL 40 mg)。地塞米松磷酸鈉注射液(鄭州紅惠制藥有限公司，1 mL/支，2 mg/mL)。RT-PCR試劑:Trizol RNA提取試劑(Invitrogen公司)和 RT-PCR試劑盒(Takara公司)。原位雜交試劑:Haptoglobin原位雜交檢測試劑盒(MK1806)購自武漢博士德公司。引物合成:兩對引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴增用引物見表1。

2 方法

2.1 小鼠接觸性皮炎模型的建立［10］小鼠于實驗前1 d用脫毛劑除去腹部毛，實驗第1天和第2天于每只小鼠去毛部位涂1%二硝基氯苯(DNCB，溶于4∶1丙酮∶橄欖油)50 μL各一次致敏。實驗第6天，病側(cè)耳內(nèi)外側(cè)各涂0.5%DNCB 10 μL 1次激發(fā);右耳內(nèi)外側(cè)各涂4∶1丙酮∶橄欖油10 μL 1次，作為對照。

表1 PCR擴增用引物

2.2 動物分組 將126只小鼠隨機分成7組，每組18只，分別為生理鹽水組，GL 5、10、20、40、80 mg/kg，地塞米松1 mg/kg組(Dexa組)。在激發(fā)后腹腔注射藥物，每天1次，每次0.2 mL，連續(xù)3 d。在激發(fā)后24、48、72 h用環(huán)鉆取下的左右耳皮損稱重后分成2份，一份用于原位雜交，另一份于－70℃凍存，以備提取總RNA。

2.3 小鼠皮膚的真表皮分離［10］用刀片刮除小鼠耳朵表面的皮脂和皮屑，除去皮下脂肪。PBS沖洗后，用鑷子分離小鼠耳的兩層皮膚，刮除軟骨，切成0.5 cm×0.5 cm小塊，加入EDTA分離液中37℃水浴，1 h后取出皮片將真表皮分開，留做原位雜交。

2.4 RT-PCR操作步驟

2.4.1 組織總RNA的提取 按照每100 mg組織中加1 mL trizol試劑，將分離好的表皮放入適量trizol試劑中，在冰浴中用勻漿機進行勻漿。勻漿速度為4檔。將勻漿后的樣品，冰浴5 min。按照每1 mL trizol試劑中加入0.2 mL氯仿的標(biāo)準(zhǔn)，加入適量氯仿，用力搖晃15 s，冰浴3 min。4℃以10 000 r/min離心15 min。離心后將上層無色水相移入另一新管中，按照每1 mL trizol試劑中加入0.5 mL異丙醇的標(biāo)準(zhǔn)，加入適量異丙醇。冰浴20 min。4℃以10 000 r/min離心10 min。去除上清，按照每1 mL trizol試劑中加入1 mL 75%乙醇的標(biāo)準(zhǔn)，加入適量75%乙醇。渦旋標(biāo)本。4℃下，以6 000 r/min離心5 min。去除上清，空氣中干燥 10 min。用0.1%DEPC水10 μL溶解RNA。

2.4.2 RNA濃度和純度測定 取1 μL RNA溶液，用0.1%DEPC水稀釋至80 μL，在紫外分光光度儀上測定RNA溶液在260 nm和280 nm處的光密度(OD)值。RNA濃度(μg/mL)=OD260×稀釋倍數(shù)×40/1 000(μg/mL)。RNA純度=OD260/ OD280，當(dāng)OD260/OD280≥1.6時，認(rèn)為所提取的RNA質(zhì)量較好，能夠進行后續(xù)操作。

2.4.3 RT-PCR反應(yīng) ①RT反應(yīng)體系:10×RT緩沖液1 μL，25 mM MgCl22 μL，dNTP混合物(各10 mM)1 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，RNA酶抑制劑0.25 μL，Random 9 mers 0.5 μL，總RNA(≤500 ng)2 μL，加0.1%DEPC水至總?cè)莘e10 μL。②RT反應(yīng)條件為:30℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃5 min，5℃5 min，1循環(huán)。③PCR反應(yīng)體系:cDNA 10 μL，5×PCR緩沖液10 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，20 pmol的上游或下游引物各0.5 μL，加0.1%DEPC水至總?cè)莘e50 μL。④PCR反應(yīng)條件為:94℃2 min，1循環(huán);94℃40 s，60℃40 s，72℃1 min，32循環(huán);72℃8 min，1循環(huán);4℃5 min，1循環(huán)。

2.4.4 Hp引物 上 游:5'-ACCTTAAACG ACGAGAAGCAATGG-3';下游:5'-AGCCAGACACGTAGCCCaCACG-3'，片段大小為475 bp。內(nèi)對照βactin:上游:5'-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3';下游:5'-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3'，片段大小為540 bp。

2.4.5 PCR產(chǎn)物檢測 將1.5%瓊脂糖凝膠置于含0.5×TBE的電泳槽中，取10 μL擴增引物與2 μL 6×上樣混合液混合后上樣。溴化乙啶染色。電泳結(jié)束后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上照相。

2.4.6 質(zhì)量控制 設(shè)立內(nèi)對照、空白和陽性對照。內(nèi)對照:用β-actin引物擴增。空白對照:用0.1%DEPC水代替RNA作為模板，進行RT-PCR反應(yīng)。陽性對照:從小鼠肝臟組織提取RNA作為模板，進行RT-PCR反應(yīng)。

2.4.7 結(jié)果判定 染色后的產(chǎn)物用 FlourChen Gel Imaging System(Alpha America)進行圖像分析。結(jié)果用Hp擴增產(chǎn)物與內(nèi)對照β-actin擴增產(chǎn)物密度之比來表示，稱為Hp相對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或Hp mRNA水平。每一密度值為4次獨立實驗所得平均值。每一實驗在相同條件下進行。結(jié)果以±s表示。

2.5 原位雜交檢測

2.5.1 操作步驟 ①表皮用4%多聚甲醛固定液室溫固定30 min，蒸餾水充分洗滌。②將表皮放入新鮮配制的0.5%H2O2的甲醇溶液中，室溫處理30 min;蒸餾水洗滌3次。③用3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶37℃消化1 min，蒸餾水洗滌1次。④每張片子加預(yù)雜交液20 μL后于37℃恒溫箱孵育4 h。⑤每張片子加含Hp寡核苷酸探針的雜交液20 μL，蓋上原位雜交專用的蓋玻片，42℃恒溫箱內(nèi)過夜。⑥37℃ 2×SSC沖洗5 min×2，0.5×SSC沖洗15 min×1，0.2×SSC沖洗15 min ×1;加封閉液，37℃濕盒內(nèi)孵育30 min。⑦加生物素化鼠抗地高辛抗體，37℃濕盒內(nèi)孵育60 min，PBS沖洗5 min×4。⑧加SABC(鏈霉親合素生物素復(fù)合體)，37℃濕盒內(nèi)孵育20 min，PBS沖洗5 min×4。⑨加生物素化過氧化物酶，37℃濕盒內(nèi)孵育20 min，PBS沖洗5 min×4。⑩加底物AEC (3-氨基-9-乙基卡巴唑)后室溫顯色30 min，蒸餾水終止。在解剖顯微鏡下鋪片，自然風(fēng)干后，甘油明膠封片。

2.5.2 質(zhì)量控制 設(shè)立陽性對照和陰性對照。陽性對照為小鼠肝臟組織，陰性對照為不含Hp mRNA的小鼠心臟組織。

2.5.3 結(jié)果判定 對每個標(biāo)本進行觀察，胞漿著色呈橘紅色為Haptoglobin mRNA陽性。染色結(jié)果分5級:無染色，為陰性(-);輕微染色，為弱陽性(±);染色較淺，為陽性(+);染色較深，為較強陽性(++);染色深，為強陽性(+++)。

3 結(jié)果

3.1 RT-PCR結(jié)果 見表2。激發(fā)后24 h，與生理鹽水組相比，GL 5 mg/kg和10 mg/kg組小鼠表皮475 bp處擴增帶表達明顯增強，GL 80 mg/kg和Dexa組擴增帶明顯減弱。激發(fā)后48 h，與生理鹽水組相比，GL 5 mg/kg和10 mg/kg組小鼠表皮475 bp處擴增帶仍表達增強，GL 80 mg/kg和Dexa未見擴增帶。激發(fā)后72 h，與生理鹽水組相比，各組表皮均未見擴增帶。總體上看，48 h擴增帶明顯弱于24 h。真皮中各時間點均未見Haptoglobin mRNA表達。內(nèi)對照:所有標(biāo)本均可用β-actin擴增出540 bp片段?？瞻讓φ?未擴增出475 bp片段或540 bp片段。陽性對照:小鼠肝臟組織用Hp引物擴增出475 bp片段，用β-actin擴增出540 bp片段。

3.2 原位雜交結(jié)果 見表3。激發(fā)后24 h，GL 5 mg/kg和10 mg/kg組染色強于生理鹽水組;GL 20 mg/kg和40 mg/kg組染色強度與生理鹽水組相似;GL 80 mg/kg和Dexa組染色弱于生理鹽水組。激發(fā)后48 h，染色強度普遍弱于24 h，GL 5 mg/kg、10 mg/kg組染色強度強于生理鹽水組; GL 20 mg/kg和40 mg/kg組染色強度與生理鹽水組相似;GL 80 mg/kg和Dexa組未見陽性染色。激發(fā)后72 h各組均未見陽性染色。各組真皮內(nèi)未見Hp mRNA表達。陽性對照:小鼠肝細(xì)胞胞漿明顯紅染。陰性對照:無胞漿特異性染色出現(xiàn)。

表2 GL對接觸性皮炎小鼠表皮Hp mRNA表達的相對值(RT-PCR結(jié)果)

表3 GL對接觸性皮炎小鼠表皮Hp mRNA表達強度的影響(原位雜交結(jié)果)

4 討論

無論是用RT-PCR還是原位雜交方法，筆者發(fā)現(xiàn)，激發(fā)后 24、48 h，與生理鹽水組相比，GL 5 mg/kg、10 mg/kg組 Hp mRNA表達增強，GL 80 mg/kg和地塞米松組表達減弱。說明甘草甜素雙相調(diào)節(jié)接觸性皮炎小鼠表皮內(nèi)結(jié)合珠蛋白的表達。低劑量GL能增強小鼠表皮內(nèi)Hp mRNA的表達，高劑量GL和地塞米松能減弱小鼠表皮內(nèi)Hp mRNA的表達。

LC本身不能合成Hp，通過胞吞及胞吐方式攝取和排出Hp，而角質(zhì)形成細(xì)胞能合成Hp［11］。Kim等［12］認(rèn)為，Hp抑制表皮內(nèi)不成熟的LC向成熟的抗原遞呈細(xì)胞轉(zhuǎn)變，具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，可能是抑制炎癥部位過度的炎癥反應(yīng)的反饋因子之一。筆者以前的實驗發(fā)現(xiàn)，GL5 mg/kg、10 mg/kg組可以使LC密度降低，同時減輕炎癥反應(yīng)，而本次實驗又顯示，兩組表皮內(nèi)Hp mRNA表達增強，因此，推測Hp可能與LC的密度降低有關(guān)。Hp mRNA表達增強，意味著更多的Hp發(fā)揮抗炎作用，使不成熟的LC向成熟的抗原遞呈細(xì)胞轉(zhuǎn)變受到抑制，從而使接觸性皮炎小鼠的炎癥反應(yīng)減輕。GL 80 mg/kg和Dexa組Hp mRNA表達減弱，發(fā)揮抗炎作用的Hp減少，這也與臨床實際情況相一致。筆者認(rèn)為，GL增加Hp mRNA表達，可能是GL素治療接觸性皮炎的機制之一。Dexa組Hp mRNA表達減弱，說明甘草甜素和地塞米松對Hp的影響是通過不同的機制實現(xiàn)的，兩者治療接觸性皮炎的機制也是不同的。

因為皮膚中Hp含量少，RT-PCR方法所用標(biāo)本不是新鮮標(biāo)本，原位雜交方法用的是新鮮標(biāo)本，此外，應(yīng)用的是鋪片而不是切片，所以本文用原位雜交的方法檢測Hp mRNA的表達，兩種方法各有不足，但結(jié)果一致，說明從mRNA水平對Hp進行的檢測是真實的。

總之，GL能增強小鼠接觸性皮炎表皮內(nèi)Hp mRNA的表達，說明GL能對急性期蛋白發(fā)揮藥理作用，這可能是其治療接觸性皮炎的機制之一。

［1］ Kazuno S，F(xiàn)ujimura T，Arai T，et al.Multi-sequential surface plasmon resonance analysis of haptoglobin-lectin complex in sera of patients with malignant and benign prostate diseases［J］.Anal Biochem，2011，419(2):241-249.

［2］ Holland BP，Step DL，Burciaga-Robles LO，et al.Effectiveness of sorting calves with high risk of developing bovine respiratory disease on the basis of serum haptoglobin concentration at the time of arrival at a feedlot［J］.Am J Vet Res，2011，72 (10):1349-1360.

［3］ Saremi B，Al-Dawood A，Winand S，et al.Bovine haptoglobin as an adipokine:serum concentrations and tissue expression in dairy cows receiving a conjugated linoleic acids supplement throughout lactation［J］.Vet Immunol Immunopathol，2012，146(3-4):201-211.

［4］ 李萍，夏立新，王合.結(jié)合珠蛋白mRNA在小鼠皮膚中的表達及炎癥調(diào)節(jié)［J］.中國免疫學(xué)雜志，2004，20(6):429-430.

［5］ Delanghe JR，Langlois MR，De Buyzere ML，et al.Vitamin C deficiency and scurvy are not only a dietary problem but are codetermined by the haptoglobin polymorphism［J］.Clin Chem，2007，53(8):1397-1400.

［6］ Watanabe J，Grijalva V，Hama S，et al.Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein［J］.J Biolhem，2009，284 (27):18292-18301.

［7］ 何多姣，李雙霞，賈天軍，等.結(jié)合珠蛋白與肝臟疾病的關(guān)系［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27(14):2678-2680.

［8］ Xie Y，Li Y，Zhang Q，et al.Haptoglobin is a natural regulator of Langerhans cell function in the skin［J］.J Dermatol Sci，2000，24:25-37.

［9］ Arredouani M，Matthijs P，Hoeyveld EV，et al.Haptoglobin directly affects T cells and suppresses T helper cell type 2-cytokine releases［J］.Immunology，2003，108(2):144-151.

［10］ 郭哲，高興華，王亞坤，等.甘草甜素對小鼠LC的影響［J］.中華皮膚科雜志，2005，38(9):557-559.

［11］ Wang H，Gao XH，Wang YK，et al.Expression of haptoglobin in human keratinocytes and Langerhans cells［J］.Br J Dermatol，2005，153(5):894-899.

［12］ Kim IS，Lee IH，Lee JH，et al.Induction of haptoglobin by all trans retinoic acid in THP-1 human monocytic cell line［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，284(3):738-742.