青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 周光明 王利華

瘤胃真菌在粗飼料消化中起著非常重要的作用，但由于瘤胃真菌屬于嚴(yán)格厭養(yǎng)菌，在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用受到一定的限制。因此，營造適合瘤胃真菌生長的環(huán)境，提高瘤胃真菌生長速度和產(chǎn)酶效率，將會(huì)對(duì)瘤胃真菌在秸稈處理、新型飼料及新酶源的開發(fā)等領(lǐng)域的廣泛作用起到一定的推動(dòng)作用。

1 環(huán)境因素

1.1 溫度對(duì)瘤胃真菌的影響 微生物的生長和酶的合成均是在酶的催化下進(jìn)行的，溫度是保證酶活性第一要素，因此發(fā)酵過程中必須保證適宜的溫度。Lowe等（1987）研究表明，厭氧真菌在36～41℃內(nèi)均能較好生長，其最適溫度為39℃，在此溫度下產(chǎn)酶活力最高，生長速度最快，培養(yǎng)溫度過高或過低酶活都會(huì)大幅度降低。

1.2 pH對(duì)瘤胃真菌的影響 在瘤胃中，pH通常保持在5.8～6.8，厭氧真菌在這一范圍內(nèi)能較好生長。 Barichievin和 Calza（1990）研究表明，培養(yǎng)基的pH對(duì)厭氧真菌有一定的影響，pH為6.0時(shí)酶活力最高。王照華（2004）研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃真菌最適pH為6.5～7.0。

2 營養(yǎng)因素

2.1 碳源的影響 碳源作為瘤胃真菌的能量來源，對(duì)瘤胃真菌的生長和生產(chǎn)的影響尤為重要。朱崇淼等（2004）在研究瘤胃真菌A4菌發(fā)酵參數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在分別以稻草秸、玉米秸、花生蔓、濾紙作為碳源時(shí)，A4菌均可產(chǎn)生具較高活力的木聚糖酶，其酶活分別為 14.3l、11.39、6.99 U/mL和 13.37 U/mL， 比活力分別為 26.96、15.95、22.29 U/mg 和25.12 U/mg；研究還發(fā)現(xiàn)，以稻草秸和濾紙為碳源時(shí)，二者培養(yǎng)液中羧甲基纖維素酶活力無顯著差異（P>0.05），且均顯著高于玉米秸組和花生秸組（P<0.05）。厲學(xué)武（2011）在以玉米秸、花生蔓、地瓜蔓及麩皮作為不同的發(fā)酵底物，篩選木聚糖酶和羧甲基纖維素酶體外培養(yǎng)的最優(yōu)發(fā)酵條件時(shí)發(fā)現(xiàn)，以玉米秸稈為碳源時(shí)木聚糖酶活為最高，與其他三種碳源之間差異顯著（P<0.05）；以地瓜蔓為碳源時(shí)，羧甲基纖維素酶活最高，與花生蔓之間差異顯著（P<0.05）；以地瓜蔓為碳源時(shí)，木聚糖酶比活力和羧甲基纖維素酶比活力均為最高，與其他三種底物之間差異性極顯著（P<0.01）。以上試驗(yàn)中，瘤胃真菌酶活差異較大，其原因可能是不同碳源誘導(dǎo)產(chǎn)生的差異。

2.2 硫源的影響 在瘤胃真菌合成含硫氨基酸的過程中為機(jī)體提供了硫源，但是瘤胃真菌利用不同的硫源的難易程度不同，而且含硫氨基酸在微生物合成的酶中又有重要的作用，所以硫源對(duì)瘤胃真菌的生長和酶活會(huì)產(chǎn)生重要的影響作用。鄭拉弟 （2009）研究硫酸鈉和硫化鈉的不同水平（0.18%、0.25%、0.30%）對(duì)瘤胃真菌數(shù)量和瘤胃羧甲基纖維素酶活力的影響，結(jié)果表明，硫酸鈉和硫化鈉均能促進(jìn)瘤胃真菌的生長；日糧干物質(zhì)中硫含量為0.25%時(shí)，瘤胃真菌的平均數(shù)量顯著增加；此外，研究還發(fā)現(xiàn)，硫酸鈉和硫化鈉均能顯著提高瘤胃羧甲基纖維素酶活力，但是總的看來，硫酸鈉的效果要優(yōu)于硫化鈉。

2.3 氮源的影響 氮源在氨基酸或者蛋白質(zhì)的合成過程中起著重要的作用，因而也會(huì)影響瘤胃真菌的生長和其產(chǎn)酶的活性。

Dijkerman等 （1996） 報(bào)道， 厭氧真菌Piromyces E2菌在以胺鹽為氮源時(shí)生長最好，以谷氨酸為氮源時(shí)也可生長，但以其他氨基酸、清蛋白、尿素、硝酸鹽為氮源時(shí)，該菌的生長受到抑制。王海榮（2006）研究發(fā)現(xiàn)，不同氮源日糧對(duì)瘤胃真菌濃度和數(shù)量影響顯著（P<0.05）；其中棉籽粕組顯著高于魚粉+麩皮組和豆粕組（P<0.05）；且瘤胃液相木聚糖酶活受氮源影響顯著（P<0.05），其中魚粉組極顯著高于棉籽粕組和豆粕組 （P<0.01），棉籽粕組又顯著高于豆粕組（P<0.05）。除較常規(guī)的飼料原料外，還有學(xué)者對(duì)酵母膏等不常用于飼料配合的原料做了相關(guān)研究。朱崇淼等（2004）研究表明，酵母膏濃度為 0、0.25、0.50 g/L的3個(gè)處理組所產(chǎn)生的木聚糖酶活及比活力均顯著低于1.0 g/L組 （P<0.05）；酵母膏濃度為0、0.25 g/L組的羧甲基纖維素酶活及比活力均顯著低于0.50 g/L和1.0 g/L組（P<0.05）。由此可見，較高濃度的酵母膏可促進(jìn)木聚糖酶和羧甲基纖維素酶的產(chǎn)生。于紅霞和王利華（2009）研究酵母膏的不同添加量（0%、5%、15%）對(duì)瘤胃真菌體外培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明，酵母膏添加量對(duì)纖維素酶活影響顯著（P<0.05），且纖維素酶活在24、48 h時(shí)最高；隨酵母膏添加量增大，培養(yǎng)底物的粗蛋白質(zhì)和真蛋白含量也明顯增大，表明酵母膏對(duì)瘤胃真菌的生長有促進(jìn)作用。

2.4 飼料中精料與粗料的影響 飼料的精粗比也會(huì)對(duì)瘤胃真菌的生長產(chǎn)生一定的影響，原因可能是由于精粗比會(huì)影響到瘤胃內(nèi)的pH，從而影響瘤胃真菌的存活。也有可能是由于精料過多會(huì)加快瘤胃細(xì)菌的增殖，使得瘤胃細(xì)菌在瘤胃內(nèi)占據(jù)了優(yōu)勢(shì)，從而影響了瘤胃真菌的生長；而過少時(shí)，瘤胃真菌又得不到充足的營養(yǎng)，生長也會(huì)受到限制。 孫云章等（2006）研究不同精粗比（0∶10、3∶7、5∶5、7∶3、10∶0）對(duì)瘤胃真菌和發(fā)酵特性的影響，結(jié)果表明，與0 h相比，發(fā)酵24 h時(shí)精粗比3∶7和5:5兩組的瘤胃真菌數(shù)量均有較大幅度的增加，其中精粗比為3∶7時(shí)增加的幅度最大，為0 h的10倍，精粗比7∶3組和全粗料組的真菌數(shù)量明顯減少，全精料組甚至檢測(cè)不到真菌；發(fā)酵48 h時(shí)，全粗料組羧甲基纖維素酶活顯著高于其他4組（P<0.05），且其他 4 組之間差異不顯著（P>0.05）；木聚糖酶酶活則隨底物精料比例的上升而顯著下降（P<0.05）。由此可見，全粗料組的羧甲基纖維素酶和木聚糖酶酶活最高，說明纖維含量豐富的底物可誘導(dǎo)共培養(yǎng)系統(tǒng)中纖維降解酶的產(chǎn)生，但是有少量的精料則更有利于瘤胃真菌的增殖，所以要根據(jù)具體需要選擇底物的精粗比，這樣才可以得到更多的產(chǎn)品。

2.5 無細(xì)胞瘤胃液的影響 無細(xì)胞瘤胃液對(duì)瘤胃真菌產(chǎn)酶促進(jìn)作用的機(jī)理尚不明確，原因可能是，瘤胃真菌在生長產(chǎn)酶過程中除了需要能量和蛋白質(zhì)，還需要一定的無機(jī)鹽甚至一些生長因子，而無細(xì)胞瘤胃液恰恰滿足了瘤胃真菌這兩大需求。朱崇淼等（2004）在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別添加不同濃度（0、50、100、170 mL/L）的無細(xì)胞瘤胃液，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明，3個(gè)較低濃度組酶活及比活力均低于高濃度組，且3個(gè)較低濃度組之間無顯著差異（P>0.05），說明培養(yǎng)基中無細(xì)胞瘤胃液必須處于較高濃度才能促進(jìn)A4菌羧甲基纖維素酶的產(chǎn)生；此外，研究還發(fā)現(xiàn)無細(xì)胞瘤胃液濃度的高低對(duì)木聚糖酶活及比活力的影響均不顯著（P>0.05），表明無細(xì)胞瘤胃液的濃度對(duì)木聚糖酶影響不大或無影響。

3 其他因素

3.1 飼料加工方式的影響 不同的飼料加工方式可能會(huì)改變飼料中纖維素和木質(zhì)素的結(jié)合狀態(tài)或者可為瘤胃真菌或其產(chǎn)生的酶提供更多的附著位點(diǎn)，而且有些加工方式還會(huì)改變精粗料之間的混合程度，從而影響瘤胃真菌的生長速度和其產(chǎn)生的酶的活性。Cann等（1993）研究發(fā)現(xiàn)，飼料經(jīng)過氨化處理后有增加瘤胃厭氧真菌的趨勢(shì)。Martin 等（1993）和 Williams等（1989）研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃中纖維物質(zhì)主要由與固體結(jié)合的瘤胃真菌釋放的酶所消化。據(jù)此，陳小連（2007）測(cè)定了發(fā)酵底物上的纖維分解酶酶活，結(jié)果顯示，飼料經(jīng)過化學(xué)處理可以特異地提高纖維分解酶酶活，NaOH處理顯著提高羧甲基纖維素酶和微晶纖維素酶酶活，而NH4HCO3處理對(duì)上述兩種酶酶活影響不顯著；與未處理組相比，NaOH和NH4HCO3這兩種處理方法都能顯著提高木聚糖酶活，并且木聚糖酶酶活隨著培養(yǎng)時(shí)間延長有逐漸升高的趨勢(shì)，且NaOH處理組效果更好。

化學(xué)處理會(huì)改變飼料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，改善飼料品質(zhì)，從而更易于被瘤胃真菌利用。但有研究發(fā)現(xiàn)，僅僅簡(jiǎn)單的混合也會(huì)改善瘤胃真菌的營養(yǎng)條件。李德允（2006）分別對(duì)肥育期荷斯坦奶牛采用兩種給料方式：全混日糧（TMR）和精粗料分離飼喂，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第6小時(shí)和第9小時(shí)，TMR試驗(yàn)組的真菌數(shù)量顯著高于精粗分離組（P<0.05）。

3.2 非離子型表面活性劑的影響 非離子型表面活性劑對(duì)瘤胃真菌的影響作用，可能是由于其能降低真菌表面的表面張力，促進(jìn)相關(guān)酶或者有害物質(zhì)的排除或者營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而加快瘤胃真菌的代謝速度引起的。Lee等（2003、1998）研究發(fā)現(xiàn)，添加0.05%的吐溫80，能顯著提高單中心真菌和多中心真菌的生長速度 （P<0.05）；然而，當(dāng)添加量為0.10%時(shí)，單中心真菌的生長受到抑制，但多中心真菌的生長速度依然顯著提高（P<0.05）。這說明低劑量的吐溫80對(duì)瘤胃真菌有營養(yǎng)改善或促進(jìn)代謝的作用，而高劑量的吐溫80對(duì)瘤胃真菌的這種作用過強(qiáng)，甚至改變了單中心真菌的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，從而表現(xiàn)出了一定的毒害作用；而多中心的真菌對(duì)這種作用有一定的耐受性，所以低濃度和高濃度的吐溫80對(duì)其均表現(xiàn)出促進(jìn)生長的作用。

4 小結(jié)

瘤胃真菌的體外發(fā)酵過程不僅受飼料加工方式、非離子型表面活性劑等因素影響，而且還受環(huán)境、營養(yǎng)等因素的影響，此外，目前還存在很多亟待解決的問題，如瘤胃真菌發(fā)酵產(chǎn)酶所需時(shí)間較長，發(fā)酵要求苛刻，發(fā)酵條件之間的組合優(yōu)化等工作仍有待完善。

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