張薇，樊輕亞，范華均，黃曉文，佘旭輝，劉小琴

(1.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，廣東廣州510006;2.廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣東廣州510006;3.信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)與檢驗(yàn)系，河南信陽(yáng)464000)

農(nóng)吉利系豆科豬屎豆屬植物野百合Crotalaria sessiliflora L.的干燥全草，也稱鼠蛋草、響鈴草、芝麻響鈴鈴、細(xì)葉芝麻鈴，其味淡、性平，有解毒、抗癌的功能，主要含有生物堿和黃酮類化合物。近年來(lái)有關(guān)農(nóng)吉利及其有效成分的研究逐漸增多［1-3］。農(nóng)吉利主要分布于亞洲東南部和日本等地，各地藥材的質(zhì)量及其差異的相關(guān)研究還未曾見有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)考慮到農(nóng)吉利中黃酮和生物堿兩類化合物在有效成分的含有量、性質(zhì)及色譜分離行為上存在較大差異，通過(guò)樣品前處理，采用液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)法鑒定其主要成分，以牡荊素和農(nóng)吉利甲素分別作為參照峰，利用高效液相色譜(HPLC)法建立了黃酮和生物堿兩類化合物有效成分的HPLC指紋圖譜?？疾炝?0批農(nóng)吉利藥材，同時(shí)定量測(cè)定了牡荊素、農(nóng)吉利甲素，為該藥材的鑒別以及其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 主要儀器與試劑LC—10液相色譜儀(帶LC-Solution色譜工作站，日本島津公司);Aglient 1100 HPLC—MS Trap XCT(美國(guó)Agilent公司);Acquity UPLC—Q—Tof Micro聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司);PJ21C-AN微波爐(美的公司);HH—6恒溫水浴鍋(江蘇金壇宏華儀器廠);RE52CS—1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);pHS—25數(shù)顯pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

牡荊素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):111687-200701);異牡荊素對(duì)照品(上海永恒生物科技公司，批號(hào):38953-85-4);農(nóng)吉利甲素對(duì)照品(美國(guó)New Jersey公司，批號(hào):315-22-0);甲醇，乙腈(色譜純，Merk公司);除注明外其他試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

指紋圖譜分析軟件為國(guó)家藥典委員會(huì)的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)。

1.2 試藥從市場(chǎng)購(gòu)買不同產(chǎn)地的農(nóng)吉利樣品共10份，藥材樣品來(lái)源見表1，經(jīng)本校中藥學(xué)院劉基柱副教授鑒定均為豆科植物野百合的干燥帶葉莖枝。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備準(zhǔn)確稱取牡荊素、異牡荊素和農(nóng)吉利甲素對(duì)照品各5.0 mg，用甲醇溶解后定容至1 0 mL，分別配制成質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL貯備液，保存于冰箱。使用時(shí)按需要逐級(jí)稀釋。

表1 農(nóng)吉利藥材來(lái)源Tab.1 Samples of Crotalaria sessiliflora L.

2.1.2 供試品溶液的制備［4-6］稱取80目的藥材粉末5.0 g于燒瓶中，加入150 mL甲醇，置于微波爐中，調(diào)節(jié)微波功率780 W，分別加熱回流50 min和100 min后，旋干，得到浸膏。平行制備兩份。

黃酮化合物供試品溶液的制備一份加入60 mL水溶解，再將其通過(guò)AB-8大孔吸附樹脂柱，用水洗滌后，吸附的黃酮化合物再用90%乙醇(V/V)洗脫，旋干洗脫液，用甲醇溶解，定容至10 mL。

生物堿供試品溶液的制備另一份加入0.1 mol/L HCl溶液50 mL溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷萃取，棄去下層，重復(fù)3次;再滴加氨水，調(diào)節(jié)上層溶液酸度至pH 10～11，然后用20 mL三氯甲烷萃取3次，合并三氯甲烷層，旋干溶劑后用甲醇溶解，并定容至5 mL。

2.2 色譜分析

2.2.1 HPLC分析條件黃酮化合物和生物堿的供試品溶液分別以甲醇(A)-0.5%冰乙酸溶液(B)和甲醇(C)-0.04%氨水溶液(D)為流動(dòng)相，采用梯度洗脫程序分離(見表2);UltimateTMC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);DAD檢測(cè)器;柱溫30℃;體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。

表2 HPLC梯度洗脫程序Tab.2 Procedures of gradient elution for flavonoids and alkaloids by HPLC

2.2.2 LC-MS分析條件

2.2.2.1 黃酮化合物的分析條件紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm;其他條件同2.2項(xiàng)下黃酮化合物的色譜分離條件。

電噴霧離子阱多級(jí)質(zhì)譜儀ESI離子源;正離子和負(fù)離子檢出模式;離子源溫度110℃;質(zhì)量掃描范圍50～600 m/z;干燥氣(N2)體積流量600 L/h;干燥氣溫度350℃;毛細(xì)管電壓3.5 kV;霧化氣壓力50 psi(1 psi=6.895 kPa)。

2.2.2.2 生物堿的分析條件Aquity UPLC BHE C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm);流動(dòng)相為乙腈(E)－0.5%乙酸胺水溶液(F)，采用梯度洗脫程序(0～3 min，5%E;3～15 min，5%～30%E;15～17 min，30%～50%E;17～20 min，50%E;20～21 min，50%～95%E);紫外檢測(cè)波長(zhǎng)216 nm;柱溫30℃;體積流量0.3 mL/min;進(jìn)樣量5 μL。

電噴霧Q-TOF質(zhì)譜儀ESI離子源;正離子檢出模式;離子源溫度100℃;質(zhì)量掃描范圍10～600 m/z;氣化室溫度350℃;霧化氣(N2)體積流量60 L/h;脫溶劑氣(N2)體積流量600 L/h;毛細(xì)管電壓3.5 kV;錐孔電壓15 eV。

2.3 方法學(xué)的考察

2.3.1 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性考察根據(jù)多批藥材的色譜圖譜的初步分析結(jié)果，取如圖1、圖2所示的9種黃酮化合物和4種生物堿組分作為共有峰，通過(guò)取同一批藥材按實(shí)驗(yàn)方法制備供試品溶液，用HPLC測(cè)定，考察了方法的精密度、重復(fù)性(取6份藥材)和穩(wěn)定性試驗(yàn)(分別在0、4、8、12、24和48 h測(cè)定)。

圖1 農(nóng)吉利藥材黃酮化合物色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of flavonoids in Crotalaria sessiliflora L.

圖2 農(nóng)吉利藥材生物堿的色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of alkaloids in Crotalaria sessiliflora L

黃酮化合物9種組分的色譜峰峰面積的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的RSD分別為0.20%～1.7%，0.11%～1.19%，0.23%～1.4%，保留時(shí)間的RSD在0.53%～1.1%之間;4種生物堿組分的色譜峰峰面積精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的RSD分別為0.19%～2.2%，0.39%～2.4%，0.22%～2.8%，保留時(shí)間的RSD在0.47%～2.1%之間。結(jié)果表明農(nóng)吉利的黃酮化合物和生物堿組分的保留時(shí)間穩(wěn)定，方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不得大于3%的規(guī)定，因此選定這9個(gè)黃酮化合物和4個(gè)生物堿組分作為指紋圖譜的共有峰。

2.3.2 共有峰的LC-MS鑒別分別取農(nóng)吉利的黃酮化合物和生物堿的供試品溶液，按照HPLC-MS條件，對(duì)色譜圖1和圖2中的各組分分別采用LCIonTrap-MS和LC-Q-TOF-MS進(jìn)行了分析，其結(jié)果見表3和表4。

根據(jù)表3和表4所示的一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜信息，黃酮化合物中的峰3和峰4(圖1)及生物堿峰1(圖2)經(jīng)與對(duì)照品對(duì)比，保留時(shí)間、紫外光譜、質(zhì)譜數(shù)據(jù)均一致，確定為牡荊素、異牡荊素和農(nóng)吉利甲素(由于農(nóng)吉利生物堿的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)采用Q-TOF-MS更容易獲得更精確的分子量信息，有利于結(jié)構(gòu)的鑒別)，其他色譜峰通過(guò)分析UV光譜、MS及MS/MS譜圖數(shù)據(jù)，并參考相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果［7-14］，初步推導(dǎo)了4個(gè)黃酮化合物和2個(gè)生物堿可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.3.3 指紋圖譜的建立取10個(gè)批次的農(nóng)吉利藥材，分別按2.1.2項(xiàng)制備黃酮化合物和生物堿的供試品溶液，并用HPLC依次測(cè)定，分別記錄黃酮化合物和生物堿90 min和40 min的色譜圖，在10批樣品中選擇了穩(wěn)定的9個(gè)黃酮化合物和4個(gè)生物堿組分作為共有峰，非共有峰占總峰面積均小于10%。鑒于牡荊素和農(nóng)吉利甲素為農(nóng)吉利的主要有效成分，且含有量較高、穩(wěn)定，其色譜峰所占比例大，故分別將其作為黃酮化合物和生物堿圖譜的參照峰。采用國(guó)家藥典委員會(huì)開發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版(2004A)處理，設(shè)定S1樣品為參照?qǐng)D譜，將其它樣品的色譜峰與參照?qǐng)D譜進(jìn)行自動(dòng)匹配，獲得農(nóng)吉利藥材指紋圖譜共有模式，以及10個(gè)批次農(nóng)吉利藥材的指紋圖譜和相對(duì)峰面積，結(jié)果分別見表5、圖3。

表3 農(nóng)吉利中黃酮化合物的LC-MS分析結(jié)果Tab.3 Obtained data of flavonoids in Crotalaria sessiliflora L.by LC-MS

表4 農(nóng)吉利中生物堿化合物的LC-MS分析結(jié)果Tab.4 Obtained data of alkaloids in Crotalaria sessiliflora L.by LC-MS

表5 10批藥材中黃酮與生物堿化合物共有峰面積及相似度分析結(jié)果Tab.5 Relative peak area of common characteristic peaks and similarity analysis for flavonoids and alkaloids in ten batches of samples

圖3 農(nóng)吉利藥材中黃酮化合物(A)和生物堿(B)的指紋色譜圖Fig.3 HPLC fingerprints of flavonoids(A)and alkaloids(B)in Crotalaria sessiliflora L.

通過(guò)計(jì)算得出農(nóng)吉利樣品指紋圖譜的共有模式，并依此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，各產(chǎn)地的10批農(nóng)吉利藥材相似度均大于0.90，黃酮和生物堿類組分相似度計(jì)算結(jié)果分別在0.975～0.995和0.908～0.990之間，符合國(guó)家藥品監(jiān)督管理局對(duì)中藥指紋圖譜相似度的要求;但不同產(chǎn)地的藥材各個(gè)組分的色譜峰之間的相對(duì)峰面積并不相同，表明藥材之間各組分含有量有明顯差異，以牡荊素和農(nóng)吉利甲素含有量最高，作為藥材的主要特征有效成分對(duì)于藥效學(xué)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及其開發(fā)利用具有重要意義。

2.3.4 主要有效成分測(cè)定按照實(shí)驗(yàn)方法制備黃酮化合物和生物堿供試品溶液，在文獻(xiàn)［5，7］基礎(chǔ)上分別測(cè)定了10批藥材農(nóng)吉利中主要有效成分牡荊素和農(nóng)吉利甲素，結(jié)果見表6。

表6 不同產(chǎn)地農(nóng)吉利中牡荊素和農(nóng)吉利甲素的測(cè)定結(jié)果±s，n=3)Tab.6 Results of determination of vitexin and monocrotaline in ten batches of samples±s，n=3)

表6 不同產(chǎn)地農(nóng)吉利中牡荊素和農(nóng)吉利甲素的測(cè)定結(jié)果±s，n=3)Tab.6 Results of determination of vitexin and monocrotaline in ten batches of samples±s，n=3)

樣品RSD/%S10.2681.20.0751.3 S20.2521.70.0691.8 S30.2462.00.0821.7 S40.4281.00.0271.5 S50.4011.80.0122.1 S60.4122.10.0171.6 S70.2541.80.0531.8 S80.1981.00.0471.7 S90.2351.40.0321.7牡荊素質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg·g－1)RSD/%農(nóng)吉利甲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg·g－1)S100.2212.00.0311.3

由表6可知，牡荊素和農(nóng)吉利甲素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別在0.221～0.428 mg/g和0.012～0.082 mg/g之間，表明各個(gè)產(chǎn)地和批次的農(nóng)吉利藥材含有的牡荊素和農(nóng)吉利甲素的量有較大差異，其RSD在1.0%～2.1%之間，均小于3.0%，質(zhì)量穩(wěn)定，方法的重復(fù)性好，精密度高。

3 討論

3.1 通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，比較了溶劑回流提取、超聲提取和微波輻射溶劑回流提取3種方法對(duì)藥材的提取效果，結(jié)果表明，3種方法均含有共同兩類有效成分的色譜峰，但微波輻射溶劑回流提取方法的提取效率更高。

3.2 采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸溶液、甲醇-乙酸以及甲醇-三乙胺溶液、甲醇-氨水溶液等體系作為流動(dòng)相分別考察了對(duì)黃酮化合物、生物堿成分色譜分離的影響。結(jié)果表明:采用甲醇-0.5%乙酸水溶液，在85 min內(nèi)可完全分離出黃酮提取液中的11個(gè)組分，用DAD檢測(cè)出9種組分在250～280 nm以及300～350 nm之間有兩個(gè)較強(qiáng)的特征吸收帶，與黃酮化合物的紫外特征吸收吻合;采用甲醇－0.04%氨水溶液梯度洗脫，在35 min內(nèi)可較好地洗脫分離出生物堿提取液中的6個(gè)組分，用DAD檢測(cè)其紫外光譜發(fā)現(xiàn)4個(gè)組分分別在200～215 nm和215～270 nm有兩個(gè)吸收譜帶，與文獻(xiàn)報(bào)道的吡咯里西啶生物堿紫外吸收光譜吻合［16］。

3.3 通過(guò)對(duì)10批不同產(chǎn)地的農(nóng)吉利藥材提取液色譜圖的研究，利用HPLC-ESI-MS/MS鑒定和推斷了幾種黃酮化合物和生物堿成分，以含有量較高的牡荊素和農(nóng)吉利甲素分別作為黃酮化合物和生物堿指紋圖譜的特征參照峰，建立了農(nóng)吉利中黃酮化合物和生物堿的HPLC指紋圖譜分析方法。分別用通過(guò)樣品前處理后的黃酮化合物和生物堿色譜圖建立指紋圖譜，各組分分離更簡(jiǎn)單、純度更高、指紋圖譜的特征性更強(qiáng)，方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性更好，10個(gè)產(chǎn)地樣品的農(nóng)吉利黃酮和生物堿的相似度均在0.9以上，符合國(guó)家對(duì)中藥指紋圖譜的技術(shù)要求。

3.4 通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地藥材指紋圖譜的研究和牡荊素和農(nóng)吉利甲素等組分的峰面積比較，可以發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的藥材基本特征相似，質(zhì)量穩(wěn)定，但各個(gè)組分的色譜峰面積及含有量不盡相同，尤其是牡荊素和農(nóng)吉利甲素主要成分的含有量相差較大(分別最大相差近2倍和8倍)，如要進(jìn)一步研究有效成分，控制藥材質(zhì)量和篩選藥材，應(yīng)固定產(chǎn)地及加工方法，以減少因此而導(dǎo)致藥材成分的變化。

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