劉 焱，譚學(xué)新，，，李 波，易 新，矯貞濤，何洋洋

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔解剖生理教研室；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，沈陽(yáng)110001)

種子細(xì)胞、支架材料和細(xì)胞-支架復(fù)合物的構(gòu)建與培養(yǎng)是組織工程技術(shù)［1］的三大要素［2］。組織工程化涎腺樣結(jié)構(gòu)的修復(fù)重建，就是利用這一技術(shù)解決目前臨床上治療困難的涎腺分泌障礙性疾病(頭頸腫瘤放療后唾液腺功能喪失、先天性唾液腺缺失、干燥綜合征等)。準(zhǔn)確觀測(cè)和客觀評(píng)估細(xì)胞在支架上的黏附、分布和生長(zhǎng)狀況至關(guān)重要。倒置顯微鏡和SEM在組織工程產(chǎn)物的形態(tài)學(xué)觀測(cè)中較常用。由于大鼠頜下腺細(xì)胞(rat submandibular gland cells，RSMGs)與絲素-殼聚糖(silk fibroin-chitosan，SFCs)復(fù)合物標(biāo)本規(guī)格為5mm x 5mm x 2mm；本實(shí)驗(yàn)還選擇了將標(biāo)本通過(guò)冰凍切片處理后經(jīng)熒光顯微鏡觀察。另一方面也應(yīng)用了激光共聚焦掃描顯微鏡(LSCM)技術(shù)進(jìn)行觀察。LSCM是斷層掃描的無(wú)損傷性連續(xù)光學(xué)切片及三維重建技術(shù)［3］，同時(shí)具有較高的橫向和縱向的分辨率［4］。通過(guò)以上四種顯微技術(shù)分別對(duì)RSMGs與SFCs體外共培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)進(jìn)行了觀測(cè)，旨在探索適宜的顯微技術(shù)對(duì)于觀察評(píng)估體外構(gòu)建組織工程化涎腺樣結(jié)構(gòu)的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器

實(shí)驗(yàn)用0～8d齡SD大鼠，雌雄不限，體重約8～10g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(SCXK (遼)2003—0009)。DMEM/F12(Hyclon，USA)，胎牛血清(Hyclon，USA)，胰蛋白酶(Hyclon，USA)，抗細(xì)胞角蛋白單克隆抗體(CK8，Sigma，USA)，抗淀粉酶抗體(anti-amylase antibody，Sigma，USA)，羊抗兔IgG(博士德，中國(guó))，DAB呈色試劑盒(博士德，中國(guó))，熒光染料 Hoechst33258(Sigma，USA)，蠶絲(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院)，殼聚糖(脫乙酰度 ＞90%，江蘇通興成生物制品廠)，倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus，Japan)，JSM-T300型掃描電子顯微鏡(島津公司，日本)，熒光顯微鏡(BX61+DP-71，Olympus，Japan)，激光掃描共聚焦顯微鏡(FV1000S-SIM/IX81，Olympus，Japan)。

1.2 方法

1.2.1 RSMGs體外培養(yǎng)、分離純化及鑒定：取0～8d齡SD大鼠，斷頸法處死、消毒。自大鼠的頸部至胸部“工”字型剪開(kāi)，完全暴露并完整取出雙側(cè)頜下腺。分離頜下腺表面薄膜、血管和纖維結(jié)締組織；再將組織剪碎成0.5mm3小塊，并均勻地平鋪于預(yù)先血清包被的培養(yǎng)瓶底部。翻轉(zhuǎn)、倒置培養(yǎng)瓶，在37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育4h，待組織塊貼壁，加入適量含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基正置培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。24h后補(bǔ)加培養(yǎng)基1m L，繼續(xù)培養(yǎng)。4d后首次全量換液，棄去大量懸浮細(xì)胞，以后每2～3d換液。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，結(jié)合酶消化法、差速貼壁法分離純化RSMGs并傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)成長(zhǎng)期的第2代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)［5］。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

取第2代 RMSGs，PBS溶液洗 3次，用含0.25%胰蛋白酶，0.01%(w/v)EDTA的溶液消化制成單細(xì)胞懸液。制作細(xì)胞爬片，使用免疫細(xì)胞化學(xué)SABC法進(jìn)行CK8及 amylase染色［6］。其中一抗為抗細(xì)胞角蛋白單克隆抗體(CK8)及抗淀粉酶抗體，二抗為山羊抗兔IgG。

1.2.2 絲素-殼聚糖支架的制備與預(yù)處理：首先將蠶絲剪碎、脫膠、溶解，獲得絲素溶液。將其過(guò)濾后注入透析袋(截流分子量為3500D)中透析，再使用聚乙二醇濃縮備用。同時(shí)將殼聚糖溶解于2%的醋酸溶液中，得到殼聚糖溶液備用。然后將制取好的絲素溶液和殼聚糖溶液按照75∶25(v/v)充分混合，置于真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥過(guò)夜，獲得絲素-殼聚糖的海綿狀的凍干支架［7］。使用前放入75%酒精中結(jié)合紫外光照射12h滅菌，最后再用無(wú)菌PBS溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，待用。

1.2.3 組織工程化涎腺樣結(jié)構(gòu)的體外構(gòu)建：在超凈工作臺(tái)中將無(wú)菌絲素-殼聚糖支架(5×5×2)mm放入24孔板中，加入DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基浸泡。盡量置換出支架孔隙內(nèi)的PBS溶液，直到培養(yǎng)液不再變淺為止吸出培養(yǎng)基。將支架置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基孵育12h，第2天倒置顯微鏡下觀察確定無(wú)菌后接種細(xì)胞。使用0.25%胰蛋白酶消化RMSGs細(xì)胞，計(jì)數(shù)，按1×105個(gè)/m L密度［8］均勻接種于絲素-殼聚糖支架上，每塊支架正反面分別接種0.1m L細(xì)胞懸液，間隔時(shí)間2h。4h后補(bǔ)加培養(yǎng)基，每隔1d換1次液。

1.3 種子細(xì)胞-支架材料復(fù)合培養(yǎng)形態(tài)學(xué)檢測(cè)

1.3.1 倒置顯微鏡：將接種了RMSGs的絲素-殼聚糖支架細(xì)胞復(fù)合物繼續(xù)培養(yǎng)。分別在第3、5、7天直接利用倒置顯微鏡觀察。

1.3.2 掃描電鏡(SEM)：選取部分共培養(yǎng)3、5、7 d的標(biāo)本以3%戊二醛溶液固定，PBS洗3次，乙醇分級(jí)脫水后將樣品浸泡于醋酸異戊酯內(nèi)。臨界點(diǎn)干燥后，噴金鍍膜，SEM鏡下觀察細(xì)胞與支架復(fù)合生長(zhǎng)的超微結(jié)構(gòu)。

1.3.3 熒光顯微鏡：選取部分共培養(yǎng)3、5、7 d的標(biāo)本直接粘著在涂有OCT的樣品臺(tái)上，于冷凍切片機(jī)(箱體溫度在-20℃以下)上制取厚度為6μm的冰凍切片［9］。將冷凍切片室溫放置10m in，待切片回溫并干燥，浸于PBS中10m in洗去OCT。熒光染料Hoechst33258用雙蒸水配制成質(zhì)量濃度為 10mg/L溶液，滴染組織切片室溫下放置 10min，用PBS溶液浸洗3次每次5min。反應(yīng)在避光濕盒中進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束時(shí)用抗熒光淬滅劑封片。在熒光顯微鏡下進(jìn)行圖像采集。

1.3.4 LSCM：最后選部分細(xì)胞支架復(fù)合物(5×5×2)mm不經(jīng)切片處理［10］，同熒光顯微鏡觀察所采取的方法染色，經(jīng)過(guò)LSCM層掃描三維重建技術(shù)觀察體外構(gòu)建的組織工程化頜下腺上細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1 RSMGs的生長(zhǎng)狀況觀察及鑒定

RSMGs原代培養(yǎng)情況的倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)，24～48h后大部分組織塊貼壁。原代細(xì)胞從組織塊邊緣游出，折光性良好；3～7 d后細(xì)胞呈現(xiàn)以組織塊為中心的放射狀排列(圖1A)。經(jīng)分離純化并傳代后，第2代細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后細(xì)胞排列整體均勻，主要呈3種形態(tài)，即圓形亮細(xì)胞、多角形暗細(xì)胞和梭形暗細(xì)胞三種形態(tài)，其中多角形細(xì)胞數(shù)目相對(duì)多(圖1B)。CK8免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽(yáng)性(圖1C)，淀粉酶免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽(yáng)性(圖1D)；提示體外培養(yǎng)的頜下腺腺細(xì)胞保持了其生物學(xué)特性。

2.2 體外構(gòu)建的組織工程化頜下腺形態(tài)學(xué)及細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察

2.2.1 倒置顯微鏡觀察：RSMGs在絲素-殼聚糖共混膜支架上生長(zhǎng)第3天時(shí)，可在支架邊緣表層觀察到部分細(xì)胞粘附長(zhǎng)入支架內(nèi)，細(xì)胞呈圓形邊界較清晰。支架內(nèi)部微環(huán)境無(wú)法準(zhǔn)確觀察(圖2A)。第5天時(shí)支架表淺層細(xì)胞量有所增加，然而細(xì)胞在支架內(nèi)伸展、粘附和生長(zhǎng)方式仍不能準(zhǔn)確觀察(圖2B)。第7天時(shí)與支架材料復(fù)合生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)明顯，且細(xì)胞在支架上呈均勻地生長(zhǎng)，支架深層復(fù)合生長(zhǎng)情況尚不易觀察評(píng)估(圖2C)。

2.2.2 SEM觀察：RSMGs在絲素-殼聚糖共混膜支架上生長(zhǎng)第3天時(shí)可觀察到，已有部分細(xì)胞表面呈現(xiàn)出微絨毛的超微結(jié)構(gòu)，細(xì)胞向支架材料伸出偽足，有扁平生長(zhǎng)的趨勢(shì)；還有部分細(xì)胞表面呈現(xiàn)圓球形，尚未向支架伸出足絲。細(xì)胞在支架材料上生長(zhǎng)狀態(tài)較好(圖3A)。第5天時(shí)細(xì)胞表面可見(jiàn)明顯凸起的微絨毛樣改變提示細(xì)胞分泌出大量促進(jìn)粘附的細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞在支架表面向各個(gè)方向伸展，呈現(xiàn)平鋪狀生長(zhǎng)，狀態(tài)良好(圖3B)。第7天時(shí)材料表面的細(xì)胞量明顯增多，而且細(xì)胞與細(xì)胞間彼此伸出偽足相連，還可見(jiàn)到完全平鋪伸展在支架表面呈片狀的細(xì)胞，提示細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)佳(圖3C)。

2.2.3 熒光顯微鏡鏡觀察：在絲素-殼聚糖共混膜支架上生長(zhǎng)的RSMGs的細(xì)胞核用熒光染料Hoechst33258染色。在460nm激發(fā)光源下采圖顯示，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色；但由于支架材料在熒光顯微鏡下受到激發(fā)光源照射也會(huì)產(chǎn)生繼發(fā)熒光圖像，為對(duì)二者加以區(qū)分，故同一視野下在620nm激發(fā)光源下再次采圖。此時(shí)圖象顯示支架材料呈現(xiàn)紅色，并將兩圖用軟件處理合成。合成后圖像中細(xì)胞核為藍(lán)染，支架材料為藍(lán)色與紅色混合色。觀察可見(jiàn)復(fù)合培養(yǎng)第3天時(shí)，RSMGs細(xì)胞核邊界清楚、形態(tài)呈圓形或橢圓形，核仁清晰可見(jiàn)。細(xì)胞較均勻的散布生長(zhǎng)在支架材料上。第5天時(shí)支架表面細(xì)胞量明顯增加，生長(zhǎng)良好。第7天時(shí)大量細(xì)胞粘附生長(zhǎng)與支架材料表面，分布均勻(圖4)。

2.2.4 LSCM觀察：同熒光顯微鏡所見(jiàn)類似，圖中僅呈現(xiàn)藍(lán)染的部分為RSMGs細(xì)胞核，呈現(xiàn)藍(lán)染混合紅染的部分為支架材料。經(jīng)過(guò)LSCM層掃描三維重建技術(shù)后可見(jiàn)，RSMGs在絲素-殼聚糖共混膜支架上生長(zhǎng)較好。細(xì)胞核的形態(tài)為邊界清楚且較為規(guī)則的圓或橢圓形，核仁明顯。對(duì)LSCM層掃描三維重建技術(shù)而言，即使較厚的光學(xué)切片也可以不行組織切片處理，而且能夠從任意角度觀察標(biāo)本的三維剖面或整體結(jié)構(gòu)，圖像的反差和分辨率也較高(圖5)(圖1～3見(jiàn)文后彩插4，圖4，5見(jiàn)封三)。

3 討論

臨床上由于各種原因(舍格倫綜合征、干燥綜合征、放射性涎腺炎、藥物過(guò)敏或自身免疫性疾病等)引起的涎腺分泌功能的障礙，導(dǎo)致唾液量降低，并產(chǎn)生一系列口腔疾病或不適，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。組織工程化涎腺樣結(jié)構(gòu)［11-12］的構(gòu)建是指利用組織工程技術(shù)，在體外培植具有生物活性，且在結(jié)構(gòu)和功能上與自體涎腺相類似的涎腺細(xì)胞［13］和支架材料［14］的復(fù)合物；培養(yǎng)一段時(shí)間后將復(fù)合物植入體內(nèi)，最終形成預(yù)定的涎腺樣組織并發(fā)揮其正常生理功能。這一技術(shù)已成為最有希望修復(fù)涎腺缺損的策略［15］。絲素蛋白(SF)，是一種纖維狀蛋白質(zhì)，具有如下的生物學(xué)特性：對(duì)于氧氣和水具有很高的通透性、低炎癥反應(yīng)性、蛋白酶的敏感性、良好的生物相容性(支持細(xì)胞粘附和生長(zhǎng))和高抗拉強(qiáng)度的靈活性。殼聚糖(Cs)是一種具有類似糖胺結(jié)構(gòu)的結(jié)晶多糖；以其良好的傷口愈合的特性、無(wú)毒性以及低異物反應(yīng)性成為了一種理想的天然醫(yī)用高分子材料。綜合以上二者的優(yōu)勢(shì)，Gobin AS等將SF與Cs共混，旨在建立一種與自然組織類似的具有較好的組織相容性，生物可降解性和可比的力學(xué)性能的支架材料［7］。She Z.等通過(guò)傅立葉變換紅外光譜(FTIR)和X-射線衍射曲線證實(shí)了SFCs是一種具有均勻多孔結(jié)構(gòu)以及納米尺度兼容性的自然衍生聚合物。通過(guò)改變二者共混的比例，SFCs支架的壓縮模量和抗壓強(qiáng)度都是可以控制的。MTT法檢測(cè)表明，SFCs支架可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，生物相容性較好［16］。

LSCM是以電信號(hào)的形式記錄圖像的，并可以采用各種模擬的和數(shù)字的電子技術(shù)進(jìn)行圖像處理［17］；LSCM還可以準(zhǔn)確的對(duì)細(xì)胞或組織厚片進(jìn)行類似CT斷層掃描的無(wú)損傷性連續(xù)光學(xué)切片及三維重建處理［3］，而且同時(shí)具有較高的橫向和縱向分辨率［4］。目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中LSCM已較廣泛用于熒光定量測(cè)量、共聚焦圖像分析、三維圖像重建、活細(xì)胞動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析和胞間通訊研究等方面［18-19］，有著廣闊的應(yīng)用前景。本文應(yīng)用LSCM對(duì)RSMGs與SFCs體外共培養(yǎng)情況進(jìn)行層掃描三維重建。作為分子影像學(xué)的方法之一［20］，LSCM可以獲得立體感較強(qiáng)的高清晰形態(tài)圖像，從三維立體角度了解和認(rèn)識(shí)了細(xì)胞支架復(fù)合物的內(nèi)部超顯微結(jié)構(gòu)。

本實(shí)驗(yàn)證明，四種顯微技術(shù)均可展示RSMGs與SFCs體外共培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)特征。倒置顯微鏡操作簡(jiǎn)單、快捷、經(jīng)濟(jì)，能迅速觀察到活細(xì)胞與支架復(fù)合情況，觀察的清晰度略低。SEM可以清晰、直觀地觀察細(xì)胞支架復(fù)合物的表面超微結(jié)構(gòu)，無(wú)法觀察到內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)組織切片處理后，熒光顯微鏡可以較準(zhǔn)確的觀測(cè)細(xì)胞在支架上的錨定和生長(zhǎng)情況。對(duì)于厚組織標(biāo)本，采用LSCM結(jié)合三維重建技術(shù)，可以不經(jīng)組織學(xué)切片處理，直接獲得清晰、精準(zhǔn)的細(xì)胞在支架表面及深層生長(zhǎng)的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)，有著十分廣闊的應(yīng)用前景。

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