張立 王定勇

南蛇藤中扁塑藤素對(duì)照品的制備及鑒定

張立 王定勇

目的建立從南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)根皮中制備扁塑藤素(pristimerin)對(duì)照品的方法。方法采用溶劑提取、硅膠柱層析和重結(jié)晶等方法對(duì)南蛇藤根皮丙酮提取物進(jìn)行分離純化，通過(guò)MS、IR、1H-NMR和13C-NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，通過(guò)薄層色譜(TLC)和高效液相色譜(HPLC)對(duì)對(duì)照品進(jìn)行純度檢測(cè)。結(jié)果從南蛇藤根皮中分離純化出扁塑藤素對(duì)照品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99.0%。結(jié)論該方法制備的扁塑藤素對(duì)照品符合中藥化學(xué)對(duì)照品的相關(guān)要求，可作為南蛇藤及其制劑質(zhì)量控制用的化學(xué)對(duì)照品。

南蛇藤根皮;南蛇藤;對(duì)照品制備

南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)系衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物，又名過(guò)山風(fēng)、降龍草等。該植物生于山谷溪邊灌叢或林邊，在我國(guó)分布廣泛，除青海和新疆未見記載外，其他地區(qū)均有分布。南蛇藤全草均可入藥，有袪風(fēng)濕，活血脈，消腫解毒等功效，常用于治療筋骨疼痛，四肢麻木，癰疽腫毒，小兒驚風(fēng)，痧癥，痢疾等癥［1］。目前已從南蛇藤植物中分離得到60余個(gè)化合物，主要為β-二氫沉香呋喃倍半萜、生物堿、三萜類，此外還含有黃酮類、有機(jī)酸類、甾體及鞣質(zhì)［2］。筆者在南蛇藤藥材的質(zhì)量控制研究過(guò)程當(dāng)中，由于缺少化學(xué)對(duì)照品，因而無(wú)法準(zhǔn)確控制南蛇藤藥材及其相關(guān)制劑的質(zhì)量，因此，迫切需要研制一種或多種對(duì)照品。扁塑藤素(pristimerin)是南蛇藤中的一種重要化學(xué)物質(zhì)，具有廣譜抗腫瘤［3，4］、抗炎［5］、抗氧化［6］等多種藥理活性，且在南蛇藤中含量較高。本文從南蛇藤中提取、分離和純化扁塑藤素，制備扁塑藤素對(duì)照品，為制定和完善南蛇藤及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供扁塑藤素對(duì)照品。

1 儀器及材料

X-6顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(北京泰克儀器有限公司，未校正);Nicolet PROT-G-460紅外光譜儀(KBr壓片，美國(guó)Nicolet公司);Agilent6120型質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司);Bruker AM-500型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo)，瑞士Bruker公司);LC-10ATvp型高效液相色譜儀(SHIMADZU公司);SPD-M10Avp紫外檢測(cè)器(SHIMADZU公司)。搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(大德中藥機(jī)械有限公司)，RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(河南省鞏義市英峪予華儀器廠)。

南蛇藤于2008年10月采自廣東陽(yáng)春市，由廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院李樹淵教授鑒定為南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)，標(biāo)本存放于廣東藥學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)，聚酰膠(60～100目，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠)，水為蒸餾水，色譜用甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 扁塑藤素的制備 取南蛇藤根皮1 kg粉碎至60目左右，置于一5L規(guī)格圓底燒瓶中，用丙酮3500 ml為提取溶劑，回流提取2次，每次提取1.5 h，抽濾，濾液合并后減壓濃縮得浸膏150 g;上述浸膏(150 g)先進(jìn)行聚酰膠(60-100目，2 kg)柱(Ф150 mm ×L1500 mm)層析，以甲醇-水 =4:1(V/V)為洗脫劑，流速≤6 ml/min，收集紅色洗脫液，減壓濃縮該洗脫液得紅色粉末狀固定(45 g);該紅色粉末狀固定(45.0 g)再進(jìn)行硅膠(200～300目，1 kg)柱(Ф100 mm×L1000 mm)色譜，流速≤6 ml/min，依次用洗脫劑 φ110000 ml、洗脫劑φ2 50000 ml洗脫色譜柱，收集φ2洗脫液部分收集(其中洗脫劑φ1由石油醚和乙酸乙酯按體積比20:1組成;洗脫劑φ2由石油醚和乙酸乙酯按體積比10∶1組成);將上述φ2洗脫液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)去除溶劑后得到扁塑藤素粗品(25.0 g);將扁塑藤素粗品用石油醚-乙酸乙酯(10:1，V/V)150 ml回流溶解，趁熱抽濾去除不溶性雜質(zhì)，濾液重新回流至澄清后先置于室溫2 h，然后放置0℃冰箱中析晶，24 h后有大量橙紅色針狀晶體析出，抽濾，收集紅色針狀晶體，即得扁塑藤素純品(8.5 g)。

圖1 扁塑藤素對(duì)照品的核磁共振氫譜

圖2 扁塑藤素對(duì)照品的核磁共振碳譜

2.2 對(duì)照品的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)鑒定橙紅色針狀晶體(石油醚-乙酸乙酯)，mp.219.0 ～220.0℃。ESI-MS(positive mode)m/z:487 ［M+Na］+，465 ［M+H］+，263，202，201;IR νmax(KBr)cm-1:3350，2940，1725，1650，1590，1520，1435，1375，1300，1245，1220，1205，1185，1155，l145，1095，1085，990，870，860，850;1H-NMR(500 MHz，CDCl3):δ 7.02(1H，d，J=7.1Hz，H-6)，6.52(1H，s，H-1)，6.34(1H，d，J=7.1Hz，H-7)，6.96(1H，brs，-OH)，3.52(3H，s，H-31)，2.23(3H，s，H-23)，1.45(3H，s，H-25)，1.25(3H，s，H-26)，1.17(3H，s，H-30)，1.08(3H，s，H-28)，0.52(3H，s，H-27);13C-NMR(125 MHz，CDCl3):δ 119.5(C-1)，178.2(C-2)，146.0(C-3)，117.2(C-4)，127.4(C-5)，134.2(C-6)，118.1(C-7)，170.3(C-8)，43.0(C-9)，164.8(C-10)，33.5(C-11)，29.6(C-12)，39.4(C-13)，45.0(C-14)，28.6(C-15)，36.4(C-16)，30.5(C-17)，44.3(C-18)，30.9(C-19)，40.4(C-20)，29.9(C-21)，34.8(C-22)，10.2(C-23)，38.2(C-25)，21.6(C-26)，18.3(C-27)，31.6(C-28)，178.7(C-29)，32.7(C-30)，51.5(C-31)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報(bào)道的扁塑藤素(pristimerin)相關(guān)數(shù)據(jù)一致。見圖1～3。

圖3 扁塑藤素對(duì)照品的質(zhì)譜

2.3 對(duì)照品的純度檢測(cè)

2.3.1 對(duì)照品的薄層色譜法檢查 將對(duì)照品用甲醇配制成1 mg/ml的溶液，分別點(diǎn)樣 5、10、20 μL，分別以石油醚-乙酸乙酯(體積比2∶1)、三氯甲烷-丙酮 (體積比3∶1)和三氯甲烷-甲醇(體積比20∶1)為展開劑，在硅膠G板上展開。分別在365 nm紫外燈、日光下觀察以及碘缸中顯色觀察。結(jié)果表明，在3種展開劑中對(duì)照品均為1個(gè)斑點(diǎn)，未見其他雜質(zhì)斑點(diǎn)，Rf值分別為0.55、0.65和0.78。

圖4 扁塑藤素對(duì)照品的HPLC圖

2.3.2 對(duì)照品的HPLC法檢查 稱取扁塑藤素0.001 g，在甲醇溶液中溶解并定容到10 ml，得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/ml的樣品溶液。取上述樣品溶液1 ml用流動(dòng)相定容到50 ml，得到質(zhì)量濃度為2 μg/ml的對(duì)照品溶液。色譜柱為迪馬公司 DiamonsilTM C18柱(5 μm，250 mm ×4.6 mm)，以甲醇-0.1%H3PO4(體積比88∶12)為流動(dòng)相，流速為1 ml/min，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為258 nm，對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為2 μg/ml，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果表明，在該色譜條件下所得HPLC圖譜中顯1個(gè)主峰，保留時(shí)間為9.82 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以峰面積歸一化法計(jì)算為99.69%。在改變流動(dòng)相分析及將釆集時(shí)間延長(zhǎng)數(shù)倍時(shí)，均未出現(xiàn)異常峰。RP-HPLC色譜圖見圖4。

［1］ 江蘇新醫(yī)學(xué)院，中藥大辭典(下冊(cè)).上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2000:1563-1567.

［2］ 陳源旺，丁立平，歐陽(yáng)明安.南蛇藤化學(xué)成分研究進(jìn)展.亞熱帶植物科學(xué)，2007，36(1):79-84.

［3］ WU C C，CHAN M L，CHEN W Y，et al.Pristimerin induces caspase-dependent apoptosis in MDA-MB-231 cells via direct effects on mitochondria.Mol.Cancer Ther， 2005， 4(8):1277-1285.

［4］ YANG H J，LANDIS-PIWOWAR K R，LIU D，et al.Pristimerin induces apoptosis by targeting the proteasome in prostate cancer cells.J Cell Biochem，2008，103:234-244.

［5］ 惠斌，吳勇杰，王鴻，等.扁蒴藤素對(duì)急性實(shí)驗(yàn)性炎癥的作田及其機(jī)制研究.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2003，19(6):656-659.

［6］ 陳長(zhǎng)瑞，李文廣，吳勇杰，等.扁蒴藤素的抗氧化與抗腫瘤作用.中藥藥理與臨床，2002，18(5):20-21.

［7］ 蔣毅，李鶴，羅思奇，等.南蛇藤活性成分的研究.中草藥，1996，27(2):73-74.

Preparation and identification of pristimerin reference substance from Celastrus orbiculatus

ZHANG Li，WANG Ding-yong.Department of Pharmacy， Guangdong Provincial Hospital of TCM， Guangzhou 510120，China

Objective To establish a method for preparation of pristimerin reference substance from the root bark of Celastrus orbiculatus Thunb.Methods Pristimerin was isolated and purified from the acetone extract of the root bark of C.orbiculatus by solvent extraction，silica gel column chromatography and re-crystallization respectively.Its structure was identified by MS，IR，1H-NMR and13C-NMR.Its purity was detected by thin layer chromatography(TLC)and high pressure liquid chromatography(HPLC).Results Pristimerin reference substance was obtained from the stem bark of C.orbiculatus，and its purity was over 99.0%.Conclusion Pristimerin reference substance prepared by this method can meet the demands of Chinese drug chemical reference substances and be used in the quality control of the C.orbiculatus materials including its preparations.

Root bark of Celastrus orbiculatus;Pristimerin;Preparation of reference substances

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2012.11.010

510120廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部(張立);廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院(王定勇)

王定勇 E-mail:wdingyong@163.com