曹長運(yùn) 孫鳳林（審校）

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院胸外科，黑龍江哈爾濱 150081

惡性腫瘤是當(dāng)今醫(yī)學(xué)上尚未攻克的難點(diǎn)和重要課題，其危害之大不言而喻。近年來關(guān)于MicroRNA（miRNA）在腫瘤領(lǐng)域的研究一直比較熱門，miRNA是1993年在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性、非編碼的單鏈小分子RNA，長度為21～25 nt（少數(shù)小于20 nt）[1-2]。當(dāng)前研究表明，miRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄成初級(jí)轉(zhuǎn)錄物（pri-miRNA），后經(jīng)Drosha酶剪切形成miRNA前體（pre-miRNA），最后在Dicer內(nèi)切酶作用下產(chǎn)生成熟的miRNA[3-4]。miRNA通過與靶mRNA的3'UTR（Untranslated regions）互補(bǔ)結(jié)合，從而誘導(dǎo)其靶點(diǎn)mRNA的降解或翻譯抑制[4]。自此以后，miRNA在大量生物物種中被發(fā)現(xiàn)，無論是在細(xì)胞的活動(dòng)及組織的發(fā)生，還是在生長發(fā)育、腫瘤的發(fā)生等這些過程中都有一定的功能[4]，可以說它目前及以后的功能、意義有待進(jìn)一步研究。miRNA在各種生物體中的廣泛發(fā)現(xiàn)及其在調(diào)控基因表達(dá)中所發(fā)揮的重要生物學(xué)作用的逐步確證，使非編碼RNA在生命中的重要作用得到了徹底的認(rèn)可。

1 miRNA的生物學(xué)功能

miRNA是一種與其他蛋白質(zhì)編碼基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本反向互補(bǔ)的小單鏈RNA基因。這些miRNA能夠抑制蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)。miRNA最先是在線蟲中觀察到的與靶轉(zhuǎn)錄物的3′UTR互補(bǔ)的小分子RNA，包括lin-4[2]和let-7[3]基因，線蟲的發(fā)育有這些RNA基因所調(diào)控。隨后miRNA被發(fā)現(xiàn)在包括從線蟲到果蠅以及人的多種組織中存在[5]，提示這些分子可能代表一個(gè)從古老的非編碼RNA（sRNA）祖先進(jìn)化而來的基因家族。目前已經(jīng)在動(dòng)物和植物體中發(fā)現(xiàn)大量的約22 nt的miRNA，并證實(shí)均為與lin-4類似的內(nèi)源性非編碼小RNA。顯然，miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控模式可能是在動(dòng)植物界中保守存在的一類重要的基因調(diào)控機(jī)制[6]。成百上千的miRNA已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)及生物信息學(xué)的方法得以鑒定，而且其中大多數(shù)在細(xì)胞里都具有高拷貝數(shù)的表達(dá)，提示miRNA是一類動(dòng)植物基因組中含量豐富的基因調(diào)控分子[3,5,7]。更重要的是，一些miRNA顯示出重要的生物功能。據(jù)預(yù)測(cè)，每一個(gè)miRNA似乎都有可能調(diào)控著大量的靶基因[8]。因此，miRNA可能具有多種生物學(xué)功能，并調(diào)控著廣譜的蛋白編碼基因。這表明miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控代表了一種轉(zhuǎn)錄后水平基因調(diào)控的基本模式，該模式可能存在于所有的生物學(xué)過程中。然而，大部分已知miRNA的生物學(xué)功能及其靶基因尚未明確。

2 MicroRNA在腫瘤中的作用

miRNA是一類小胞質(zhì)RNA，它可以通過抑制翻譯或者指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物降解的方式調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)[9]。第一個(gè)miRNA是在線蟲（C.elegans）中識(shí)別到的，是鑒定改變發(fā)育時(shí)間的突變體時(shí)遺傳篩選的結(jié)果[10]。隨后，人們發(fā)現(xiàn)了miRNA廣泛參與調(diào)控真核生物的發(fā)育和代謝過程，包括兩側(cè)的不對(duì)稱性、凋亡、細(xì)胞增殖、脂肪代謝、胰島素分泌、應(yīng)激反應(yīng)和開花[11-12]。在哺乳動(dòng)物中，研究者們正在評(píng)估m(xù)iRNA在疾病發(fā)生中的作用。miRNA參與調(diào)控基本的細(xì)胞過程，例如細(xì)胞分化和增殖。許多miRNA基因位于與疾病相關(guān)的基因位點(diǎn)的附近，而且在癌癥發(fā)生過程中有差異表達(dá)，這些認(rèn)識(shí)表明miRNA參與調(diào)控包括癌癥在內(nèi)的多種疾病[10,13-14]。miRNA和癌癥有關(guān)的報(bào)道出現(xiàn)于2002年，報(bào)道了癌細(xì)胞特異的miRNA缺失或表達(dá)下調(diào)[15]。緊接著一系列的報(bào)道指出在各種癌細(xì)胞中許多miRNA分子的表達(dá)都有顯著的降低[11-12,15]，但也有很少的miRNA分子表達(dá)是上調(diào)的[16-17]?，F(xiàn)在這樣說法已經(jīng)有更多的證據(jù)支持，即雖然特殊的miRNA在某種癌癥可上調(diào)[18]，但普遍的miRNA下調(diào)是人類惡性腫瘤的共同特征，發(fā)揮著表型轉(zhuǎn)變的因果作用[19]。這種現(xiàn)象機(jī)制和它所提供的優(yōu)勢(shì)仍然知之甚少。miRNA協(xié)調(diào)整個(gè)基因簇的表達(dá)，控制哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組成規(guī)模[20]。大量的證據(jù)表明，在癌癥中miRNA的表達(dá)是失調(diào)能力的，是被其他機(jī)制抑制的，miRNA的基因座通過遺傳和表觀遺傳缺陷來體現(xiàn)出來的，miRNA作為一種特殊的標(biāo)志，可以作為腫瘤分類和臨床預(yù)后[21]。然而，很少有人知道其基本機(jī)制。最近有學(xué)者深入的研究了這個(gè)問題，筆者找到一個(gè)microRNA家族，miR-103/107抑制在Dicer酶的表達(dá)，造成普遍的miRNA下調(diào)。miR-103/107促進(jìn)EMT特點(diǎn)，對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移有關(guān)和轉(zhuǎn)移傳播[22]。

現(xiàn)在越來越多的證據(jù)顯示miRNA（包括miR-15/miR-16、let-7及miR-155/BIC等）的失調(diào)與某些類型的癌癥相關(guān)[11,15-16]。并且，miRNA表達(dá)模型被用來特異地區(qū)分幾種人類癌癥[23]。雖然miRNA在癌癥中確切的生物學(xué)作用還不為人所知，但是最近指出有些miRNA被c-Myc調(diào)節(jié)，c-Myc基因的失衡和功能是人類惡性腫瘤最常見的異常表現(xiàn)之一。近年來，腫瘤的基因遺傳背景越來越受到重視，已經(jīng)有研究者應(yīng)用miRNAs來分類腫瘤[24]。一般來說，一個(gè)miRNA調(diào)節(jié)了上百個(gè)下游基因，所以，對(duì)比基因表達(dá)譜，腫瘤的miRNA表達(dá)譜將是更有潛力的腫瘤分型依據(jù)[19]。有研究報(bào)道，miR-378在眾多的腫瘤細(xì)胞系中過表達(dá)[25]，在膠質(zhì)瘤和肺癌等腫瘤的研究中，有報(bào)道m(xù)iR-328、miR-378等能夠增強(qiáng)腫瘤的血管生成作用，促進(jìn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[26-27]。基因-miRNA相互作用，也許在腫瘤的發(fā)展和發(fā)生中起到非常重要的作用。如果癌癥通過持續(xù)的積累和遺傳選擇以及表遺傳改變逐漸發(fā)展，使細(xì)胞生存、復(fù)制，從而建立能抵抗凋亡的不正常增殖模式，那么大量遺傳組分都會(huì)參與這樣一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。

miRNA具有通過調(diào)節(jié)眾多的下游基因參與調(diào)控多個(gè)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的生物學(xué)特性，使得其具有作為疾病早期預(yù)測(cè)、腫瘤發(fā)生及預(yù)后評(píng)判的熱點(diǎn)潛力工具。miRNA能為我們更好地認(rèn)識(shí)癌癥的控制提供一個(gè)新的途徑。miRNA可能不能控制癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移這么重要的變化，但能微調(diào)正常細(xì)胞生長的組織內(nèi)平衡。

這種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由在多種水平調(diào)控基因組結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)的miRNA和在RNA水平調(diào)控相互作用網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)編碼基因構(gòu)成。在復(fù)雜的癌癥發(fā)生發(fā)展過程中，筆者推測(cè)新鑒定出來的miRNA與癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及血管發(fā)生的調(diào)控機(jī)制有著某種重要的關(guān)聯(lián)性。

3 MicroRNA基因表達(dá)水平的檢測(cè)

目前對(duì)miRNA的認(rèn)知還沒有那么非常清楚，但有一項(xiàng)生物學(xué)特征卻是非常明確，那就是具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。這個(gè)特點(diǎn)就說明其可能成為一種新的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物，下面總結(jié)了經(jīng)典的檢測(cè)手段。

3.1 基因克隆

由于miRNA很小，實(shí)驗(yàn)中很容易就丟失了，用一般方法建立的cDNA文庫中不含有這種基因片段。針對(duì)這個(gè)特點(diǎn)，筆者富集序列很小的RNA來建立cDNA文庫。構(gòu)建miRNA的cDNA文庫的方法通常有兩種，①將所有的RNA通過凝膠電泳分離回收小片段RNA，連上接頭、逆轉(zhuǎn)錄、進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將片段克隆到載體，最后對(duì)每個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)定[29]。②分離出小片段RNA，進(jìn)行多聚腺苷酸化反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄、再進(jìn)行鳥苷酸化反應(yīng)，隨后進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序[30]，最后通過Northern雜交等予以驗(yàn)證。

3.2 MicroRNA芯片

MicroRNA芯片是一門復(fù)雜的技術(shù)，它提供了大范圍檢測(cè)miRNA的平臺(tái)，并且著眼于不同生物樣品中的表達(dá)有差異的miRNA。microRNA芯片是檢測(cè)樣品中每個(gè)miRNA的表達(dá)水平的首要方法。但要想從片段小、分子間差別不大的miRNA中分離提取出有一定豐度且高品質(zhì)的miRNA組分，對(duì)芯片的要求是極其嚴(yán)格的，需選擇專用的miRNA提取盒。miRNA芯片的優(yōu)點(diǎn)是可以高通量、快速的、多個(gè)miRNA進(jìn)行檢測(cè)，缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴，可重復(fù)性差，靈敏度一般。通常用于初篩。

3.3 Northern blot

Northern雜交是RNA檢測(cè)方法中可靠的和經(jīng)典的技術(shù)，也被廣泛的應(yīng)用于研究miRNA的重要方法。靈敏性高及利用RNA marker來檢測(cè)小RNA的分子大小是此方法的重要特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)流程清晰便捷，主要包括：變性處理后進(jìn)行的RNA電泳，分離總RNA；將變性RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜；轉(zhuǎn)移前后進(jìn)行的RNA染色；雜交和放射自顯影，最后對(duì)圖像進(jìn)行分析。Northern雜交也存在著一些缺點(diǎn)，比如需要的樣品量大，檢測(cè)的范圍小，還可能出現(xiàn)錯(cuò)配雜交等問題，不適合大范圍的篩選實(shí)驗(yàn)。

3.4 實(shí)時(shí)定量PCR

Real-time PCR是定量檢測(cè)miRNA的重要方法，在使用Taqman探針法時(shí)，可明顯提高特異性。主要包括：提取miRNA，然后混合引物，依次要變性，復(fù)性，使模板與引物配對(duì)，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后以cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR。這種方法的優(yōu)點(diǎn)其一是樣品需量低，其二是靈敏度和特異性都很高，其三是測(cè)量范圍較寬，但成本較高是它的重要缺點(diǎn)。

3.5 其他方法

還有如液相芯片技術(shù)[31]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[32]、原位雜交[33]、Small-target quantitative PCR技術(shù)[34]等。這些方法大多數(shù)可特異的、高效的進(jìn)行定性、定量分析。

4 總結(jié)和展望

通過針對(duì)miRNA在基因功能調(diào)控中突出作用的不斷深入研究和開發(fā)，這能為腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究提供嶄新的思路和平臺(tái)。縱觀所有關(guān)研究，miRNA在腫瘤中的研究只能算是初期，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制有待深入研究，包括通過功能學(xué)試驗(yàn)明確miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具體作用、miRNA的靶蛋白或靶基因的確定等；miRNA只是初步用在腫瘤的診斷、臨床分期以及臨床治療，尤為重要的是確定miRNA譜或者miRNA在腫瘤中具體表達(dá)意義，如何收集標(biāo)本和具體操作方法也是目前需要研究的內(nèi)容。因此，要想解決這些問題，我們還有很長一段路要走。只要將以上疑惑徹底弄清，定會(huì)幫助我們對(duì)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展能進(jìn)一步了解，而且還能為我們對(duì)腫瘤的診治及預(yù)后提供強(qiáng)有力的支持。

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