惠長野，黃勝和，曹虹，張艷芳

1. 深圳市職業(yè)病防治院，深圳 518001； 2. 南方醫(yī)科大學(xué)，廣州 510515

Omptins家族蛋白是在腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一類定位于外膜的蛋白酶，包括大腸埃希菌外膜蛋白酶T(outer membrane protease T, OmpT)和OmpP、沙門菌PgtE、鼠疫耶爾森菌Pla和福氏志賀菌SopA[1]。它們的氨基酸序列具有高度同源性(45%～80%)，并具有保守的空間構(gòu)象，由反向平行的β片層包繞而形成中空的桶狀結(jié)構(gòu)，錨定在菌體外膜，酶活性中心結(jié)構(gòu)域伸向外膜空間，行使生物學(xué)功能[2]。Omptins具有絲氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶特點(diǎn)，脂多糖對(duì)酶活性的發(fā)揮至關(guān)重要[3]。近年來越來越多的研究表明，Omptins與革蘭陰性菌毒力相關(guān)，但成員之間有較大差異[4]。

編碼大腸埃希菌OmpT的基因ompT長久以來被認(rèn)為是一種管家基因。處于高濃度尿素的細(xì)胞裂解液中，OmpT仍保持水解活性，這是引起重組蛋白降解的主要原因[5]。目前，商品化的原核表達(dá)宿主菌都是ompT缺陷型。OmpT可能與大腸埃希菌毒力相關(guān)，一方面源于Omptins家族Pla及PgtE被證明是耶爾森菌和沙門菌重要的毒力因子；另一方面主要來源于大量的流行病學(xué)分析數(shù)據(jù)，如不同國家和地區(qū)學(xué)者收集到的尿路致病性大腸埃希菌(uropathogenicEscherichiacoli, UPEC)中OmpT都有很高的檢出率，認(rèn)為其可能是泌尿道感染的細(xì)菌毒力因子[6-8]。有研究表明，OmpT在大腸埃希菌腦膜炎分離株中的分布高達(dá)96%，顯著高于其他典型腦膜炎致病毒力因子[9]。皮膚和軟組織感染相關(guān)的102株大腸埃希菌分離株中，80%攜帶有OmpT，而其他毒力因子檢出率最高的CNF1僅為32%[10]。

大腸埃希菌OmpT作為多功能蛋白，以多機(jī)制參與細(xì)菌感染侵襲過程。目前，對(duì)其致病機(jī)制的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：①通過發(fā)揮蛋白酶活性，參與毒力因子前體加工；②降解宿主細(xì)胞分泌的抗菌肽，有利于細(xì)菌在體內(nèi)存活；③通過激活纖溶酶原降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)侵襲；④OmpT本身作為細(xì)菌黏附因子介導(dǎo)黏附侵襲過程；⑤可能與一些毒力基因的表達(dá)調(diào)控相關(guān)。

1 尿路感染與UPEC

尿路感染是繼呼吸道感染的機(jī)體第二大易感染疾病，病原體以UPEC為主[11]。尿路感染多發(fā)于機(jī)體免疫力低下者，以及膀胱、腎遠(yuǎn)球小管等部位生理或功能紊亂的人群[7]。健康人中尿路感染并不常見，這與人體完善的防御機(jī)制有關(guān)。無菌尿液的沖刷不斷清除少量入侵細(xì)菌，避免上行感染發(fā)生，同時(shí)天然免疫構(gòu)成了機(jī)體的主要防線。尿路上皮細(xì)胞可分泌多種蛋白以抵御微生物入侵，已知的有Tamm-Horsfall、乳鐵蛋白(lactoferrin)和脂鈣蛋白(lipocalin)，這些黏蛋白覆蓋于上皮細(xì)胞表面，不利于致病菌黏附。組成型和誘導(dǎo)型抗菌肽，如α防御素(α-defensin)、β防御素、抗菌肽(cathelicidin)等的分泌，可直接殺傷侵入的病原菌[12,13]。尿路上皮同時(shí)存在2類分子：一類是受體分子(細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)、單純蛋白、糖蛋白等)，可識(shí)別并結(jié)合特異性的致病菌黏附相關(guān)因子；另一類是效應(yīng)分子，包括抗菌肽類和一些可快速中和入侵病菌的蛋白，化學(xué)因子及細(xì)胞因子的分泌可誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞向感染部位聚集，激活后吞噬能力大大提高[14]。

尿路感染好發(fā)于女性，與其尿路解剖生理有關(guān)，女性尿道短，尿道口在會(huì)陰部和肛門附近。UPEC易沿尿道上行，借助1型菌毛等黏附因子定植于膀胱。如何突破天然免疫防御并成功侵襲膀胱上皮細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)感染的關(guān)鍵[15]。FimH、CNF1、SurA、OmpA等已通過細(xì)胞模型和動(dòng)物模型證實(shí)與UPEC黏附侵襲毒力相關(guān)[11,16]。OmpT、KpsMT等在糞大腸菌群中也有較高分布，但在UPEC中有更高的檢出率，是否與UPEC毒力有關(guān)還有待相關(guān)研究證實(shí)[6,7,9]。

2 OmpT的底物與切割位點(diǎn)

OmpT是引起外源重組蛋白降解的最重要蛋白水解酶，可從已鑒定的OmpT底物來推測(cè)其在體內(nèi)的生理功能[17]。表1列出已證實(shí)的OmpT底物肽或蛋白的作用位點(diǎn)，可看出OmpT主要識(shí)別并水解由堿性氨基酸Arg和Lys殘基組成的肽鍵，而旁側(cè)氨基酸序列特征性不強(qiáng)[17]。攜帶有α溶血素(α-hemolysin, HlyA)信號(hào)肽的融合蛋白，分泌過程中通過大腸埃希菌外膜時(shí)被OmpT剪切去除信號(hào)肽[18]。OmpT參與霍亂弧菌毒素蛋白前體的翻譯后加工[19]。從已有的研究報(bào)道推測(cè)，OmpT可能與某些毒力因子前體分泌過程的剪切加工有關(guān)。

表1 已鑒定的OmpT底物及識(shí)別序列Tab.1 Substrates and cleavage sites of OmpT

近年來研究表明，水解陽離子抗菌肽和抵抗宿主天然免疫防御體系可能是OmpT的主要生理功能之一[20, 21]。魚精蛋白主成分salmine AI富含連續(xù)精氨酸，ompT+株表現(xiàn)出對(duì)其明顯的抗性，salmine AI已作為OmpT體外活性測(cè)定的最適底物[3]。在機(jī)體正常情況下，天然免疫重要效應(yīng)分子抗菌肽始終維持較低水平表達(dá)。當(dāng)致病菌入侵時(shí)，抗菌肽被迅速誘導(dǎo)至一個(gè)高水平表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗感染作用[13]。在感染初期，通常在幾分鐘至幾小時(shí)，天然免疫激活，在入侵病原菌復(fù)蘇及繁殖之前，就將其完全清除，且不引起明顯的炎癥反應(yīng)[7]。相比之下，適應(yīng)性免疫(高度專一的抗體、T細(xì)胞受體依賴的淋巴細(xì)胞等)在徹底消滅病原體及防止再感染方面有重要意義[13]。

防御素在病原體入侵時(shí)可迅速誘導(dǎo)表達(dá)，OmpT被證實(shí)與UPEC抵抗這類抗菌肽密切相關(guān)，有利于細(xì)菌在尿路中存活而引發(fā)感染[20]。對(duì)防御素這類廣泛分布于動(dòng)植物界的陽離子抗菌肽序列進(jìn)行分析，富含堿性氨基酸及半胱氨酸是防御素的共性。表2列舉了已鑒定的人源防御素序列，這些連續(xù)堿性氨基酸殘基形成的肽鍵作為OmpT水解滅活的位點(diǎn)還有待證實(shí)。但最新研究成果很好地支持了這一假說，腸出血性及腸致病性大腸埃希菌OmpT被證實(shí)與LL-37抗性有關(guān)，質(zhì)譜表明OmpT正是作用于LL-37的2個(gè)假定水解位點(diǎn)(圖1A)[22]。底物抗菌肽二級(jí)結(jié)構(gòu)和假定水解位點(diǎn)如圖1所示(PyMol軟件作圖)。此外，Omptins家族成員OmpP和PgtE也被證實(shí)與抗菌肽抵抗有關(guān)[23,24]。

ZF-RNase-3是來源于斑馬魚的RNA酶，同時(shí)具有殺菌活性。 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，ZF-RNase-3

A: LL-37 (PDB ID: 2K6O)，LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES；B: β-defensin-2 (PDB ID: 1E4Q)，PVTCLKSGAICHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCCKKP；C: α-defensin-1 (PDB ID: 3LO4)，ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC.

表2 已鑒定的人源防御素氨基酸序列Tab.2 Amino acid sequences of human defensins

需利用病原體蛋白酶的加工才能生成具有抗菌活性的肽段，OmpT被證實(shí)是這一環(huán)節(jié)的關(guān)鍵酶[25]。這可能是病原體與宿主協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。OmpT不僅作用于宿主抗菌肽，還可作用于細(xì)菌素。ColE2是大腸埃希菌分泌的、具有殺菌活性的內(nèi)切酶，ColE2與免疫蛋白Im2由細(xì)菌以聚合體的形式分泌，有效降低了ColE2對(duì)產(chǎn)生菌自身的殺滅活性，更重要的是防止OmpT對(duì)ColE2的水解滅活[26]。

3 OmpT與細(xì)菌毒力

3.1 OmpT激活纖溶酶原活性

纖溶酶在體內(nèi)具有抗凝及降解細(xì)胞外基質(zhì)的活性，許多致病菌都產(chǎn)生并利用纖溶酶原激活劑作用于凝血系統(tǒng)，一些致病株利用表面受體結(jié)合纖溶酶(原)并使酶激活免受生理抑制，有利于其突破正常組織屏障[27]。大腸埃希菌外膜組分被證實(shí)具有激活纖溶酶原的活性，OmpT與耶爾森菌的纖溶酶原激活劑Pla同源性達(dá)47%[28]。McCarter 等[17]利用噬菌體展示肽庫研究OmpT的底物專一性，確定OmpT識(shí)別位點(diǎn)上下游6個(gè)氨基酸的分布概率，其中包括天然纖溶酶原激活位點(diǎn)。純化的OmpT蛋白最終被證實(shí)是纖溶酶原的弱激活劑[29]。

凝血系統(tǒng)的激活是機(jī)體抗感染機(jī)制之一，纖維蛋白沉積可有效阻止病原體侵襲擴(kuò)散，激活纖溶酶原是病原體的抵抗策略之一[27]。來源于人體的內(nèi)源性抗凝劑——組織因子途徑抑制劑(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)被證實(shí)是Omptins的理想底物，Pla、OmpT和PgtE對(duì)其水解滅活的速率甚至高于對(duì)纖溶酶原的激活[30]。這可能是人體TFPI在長期進(jìn)化過程中產(chǎn)生對(duì)抗病原體抗凝的機(jī)制，也是嚴(yán)重感染引發(fā)敗血癥患者出現(xiàn)血管內(nèi)彌散性凝血的原因之一。

3.2 OmpT提高細(xì)菌黏附活性

ompT敲除可導(dǎo)致新生兒腦膜炎大腸埃希菌分離株RS218在體外黏附腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力下降20%[31]。UPEC臨床分離株CFT073缺失ompT，重要的菌毛黏附因子FimH等毒力因子表達(dá)不受影響，但體外黏附人膀胱上皮細(xì)胞及體內(nèi)定植小鼠膀胱的能力顯著降低[32]。ompT敲除株回補(bǔ)ompT表達(dá)質(zhì)粒及ompT點(diǎn)突變致酶活性喪失質(zhì)粒，菌株黏附能力均得到恢復(fù)，提示OmpT對(duì)菌株黏附能力的影響不是通過酶活性介導(dǎo)的[33]。OmpT具有蛋白水解活性，不同于一般的細(xì)菌黏附因子，上皮細(xì)胞中OmpT相互作用蛋白的分離和鑒定有利于OmpT介導(dǎo)細(xì)菌黏附詳細(xì)機(jī)制的闡明。

菌毛黏附因子介導(dǎo)微生物黏附侵襲在致病性大腸埃希菌中較常見。在致新生兒腦膜炎大腸埃希菌分離株中可被唾液酸半乳糖苷識(shí)別的S型菌毛很普遍，但其在腦膜炎發(fā)病中的作用還未充分闡明[31]。Parkkinen等[34]研究表明，SfaA可捕獲纖溶酶原并促進(jìn)酶原激活，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)菌穿越基底膜。OmpT及SfaA在纖溶酶原激活過程中是否存在協(xié)同作用，有待進(jìn)一步研究。

3.3 OmpT的表達(dá)調(diào)控

ToxR是霍亂弧菌的一種跨膜DNA結(jié)合蛋白，它至少參與了17個(gè)毒力基因的表達(dá)調(diào)控。ompT是已知唯一被其下調(diào)的毒力基因。關(guān)于OmpT在致病過程中的表達(dá)調(diào)控，知之甚少。Li等研究表明，ToxR直接結(jié)合到ompT啟動(dòng)子A/T富集區(qū)，在轉(zhuǎn)錄水平抑制OmpT表達(dá)，cAMP受體蛋白可激活OmpT表達(dá)[35]。在216株UPEC中，ompT與kpsMT、cnf1、sfa、prf這些毒力基因遺傳學(xué)上并非緊密連鎖，推測(cè)在功能及調(diào)控上相關(guān)[8]。不同來源的ompT+株對(duì)同種抗菌肽的抵抗能力并不相同，各分離株中ompT轉(zhuǎn)錄水平存在較大差異。相當(dāng)一部分ompT+株中OmpT一般情況下并不表達(dá)[5,20]。最新研究指出，抗菌肽接觸病原體后，與抗性相關(guān)的基因表達(dá)可迅速上調(diào)[22]。針對(duì)不同感染組織內(nèi)環(huán)境的差異，細(xì)菌在與宿主長期斗爭中進(jìn)化了一套精密的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)語

OmpT是一種毒力相關(guān)因子，與大腸埃希菌尿路感染相關(guān)。作為一種多功能蛋白，抵抗宿主陽離子抗菌肽、激活纖溶酶原是其重要的生理功能。此外，OmpT是否以黏附因子的身份介導(dǎo)細(xì)菌侵襲還有待進(jìn)一步研究。隨著細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥日趨嚴(yán)重，人們對(duì)抗菌肽寄予厚望，而對(duì)OmpT這類蛋白酶毒力機(jī)制的深入研究有利于新型耐酶抗菌肽的設(shè)計(jì)，也為探尋新的抗感染途徑、篩選新藥作用靶點(diǎn)提供了可能。

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