王貝貝，吳淑燕，黃瑞

蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院病原生物學(xué)系，蘇州 215123

巨噬細胞(macrophage)是由血液中的單核細胞進入組織器官分化而成。作為機體天然免疫的重要細胞，巨噬細胞對感染可發(fā)生迅速反應(yīng)，既能直接吞噬、殺傷病原體而發(fā)揮非特異性免疫應(yīng)答作用，又能參與抗原的攝取、加工、處理并呈遞給T輔助細胞(T helper，Th細胞)，啟動特異性免疫應(yīng)答，從而將天然免疫與適應(yīng)性免疫聯(lián)系起來，在抗感染免疫中具有非常重要的作用。機體感染后，一方面沙門菌作為兼性胞內(nèi)菌，被巨噬細胞吞噬、殺傷；另一方面，以巨噬細胞作為庇護場所，抵抗藥物、抗體及機體非特異性免疫分子如補體、溶菌酶和防御素等的殺傷。

1 巨噬細胞活化對沙門菌的清除

巨噬細胞作為機體免疫系統(tǒng)的重要細胞，處于靜息或非活化狀態(tài)時并無殺傷作用。在組織微環(huán)境中，巨噬細胞的激活受多種因素影響，如入侵病原體的菌體成分及其產(chǎn)物、細胞因子、植物血凝素、寄生蟲等的刺激，都會導(dǎo)致巨噬細胞活化并作出迅速應(yīng)答[1]。活化后的巨噬細胞分化為2個不同亞群：M1和M2。M1即經(jīng)典活化的巨噬細胞(classically activated macrophage，CAM)，主要通過干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)和細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)活化，具有吞噬殺菌、釋放炎癥介質(zhì)、呈遞抗原和啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答的功能，是機體抵御外來物質(zhì)的重要防線。M2即替代性活化的巨噬細胞(alternatively activated macrophage，AAM)。由于活化的誘導(dǎo)物質(zhì)不同，細胞表面亦出現(xiàn)不同的活化標記而再分為3個亞群：M2a，由白細胞介素4(interleukin 4，IL-4)或IL-13誘導(dǎo)，具有抗炎作用；M2b，由免疫復(fù)合物和部分Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)或白細胞介素1受體(interleukin 1 receptor，IL-1R)的激動劑誘導(dǎo)，具有抗原呈遞作用；M2c，由IL-10和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)，具有很強的免疫調(diào)節(jié)作用和組織修復(fù)能力，但殺滅微生物的功能很弱。

Chakravortty等證明，沙門菌致病島2(Salmonellapathogenicity island 2，SPI2)可阻止亞硝酸鹽在未活化巨噬細胞的含沙門菌囊泡(Salmonella-containing vacuole，SCV)中積累，從而使細菌在巨噬細胞中存活[2]。SPI2在巨噬細胞內(nèi)的表達依賴反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白PhoP。當(dāng)巨噬細胞被IFN-γ激活后，PhoP及組氨酸蛋白激酶PhoQ (PhoP-PhoQ)的活性可被高濃度的活性氮中間產(chǎn)物(reactive nitrogen intermediate，RNI)抑制，導(dǎo)致SPI2表達受抑，促進SCV成熟，并與溶酶體融合后殺傷入侵細菌[3]。

巨噬細胞對控制和清除宿主細胞中的沙門菌非常重要。當(dāng)病原體入侵時，巨噬細胞自身及其產(chǎn)物所共有的某些高度保守的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，被巨噬細胞表面的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別，進而將其攝入胞內(nèi)形成吞噬小體(phagosome)。后者進一步與胞內(nèi)溶酶體融合，形成吞噬溶酶體(phagolysosome)后通過氧依賴性和非氧依賴性途徑等方式消化和清除病原體。此外，細胞因子也發(fā)揮極其重要的作用。沙門菌及其產(chǎn)物能增加巨噬細胞中mRNA表達，使其分泌多種細胞因子，如炎癥細胞因子IL-1，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，IL-6、趨化因子如炎性蛋白1α(inflammatory protein 1α，MIP-1α)、MIP-1β、MIP-2α，以及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)。

在氧依賴性途徑中，活性氧中間產(chǎn)物(reactive oxygen intermediate，ROI)和RNI是2個主要的效應(yīng)分子。ROI由吞噬細胞NADPH氧化酶產(chǎn)生，RNI由NOS2基因編碼的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)產(chǎn)生。ROI可介導(dǎo)病原體快速清除，且與巨噬細胞早期殺傷沙門菌有關(guān)。在沙門菌感染早期，主要是依賴NADPH氧化酶在吞噬小體中的定位控制其生長。當(dāng)TNF-α與腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)p55結(jié)合活化受體后，ROI對胞內(nèi)菌的殺傷能力增強。在沙門菌感染后期，NOS2依賴性的RNI產(chǎn)物在限制細菌生長中起重要作用。NOS2受IFN-γ、IL-12和IL-18等細胞因子的刺激，表達量顯著增加[4]。IL-12是由p35和p40兩個亞基組成的異源二聚體。沙門菌感染可導(dǎo)致IL-12 p40在派爾伊結(jié)(Peyer)、腸系膜淋巴結(jié)、脾和肝中的表達量顯著上升，而IL-12 p35的表達不受影響[5]。IL-12的另一個重要作用是誘導(dǎo)自然殺傷細胞(natural killer，NK細胞)和T細胞產(chǎn)生IFN-γ，激活巨噬細胞呈遞抗原和殺菌的能力。IFN-γ可調(diào)節(jié)單核-巨噬細胞，增強TNF-α和IL-12釋放，形成級聯(lián)瀑布效應(yīng)。IL-18是Th1型細胞因子，在宿主抵御沙門菌感染中發(fā)揮重要作用。用抗體中和IL-18可導(dǎo)致動物脾和肝中細菌數(shù)量增加，宿主存活率降低。用IL-18干預(yù)后，脾和肝中細菌數(shù)量降低，宿主存活率上升[6]。與IL-12一樣，IL-18可誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，通過激發(fā)IFN-γ分泌促進Th1型細胞增殖，進一步誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β和IL-8等細胞因子產(chǎn)生，增強機體免疫調(diào)節(jié)和抗感染的能力。此外，鼠傷寒沙門菌可刺激巨噬細胞分泌IL-10，不僅可抑制細胞的殺菌作用，還可為該菌在細胞中增殖提供良好的宿主環(huán)境[7]。

目前，越來越多的研究報道沙門菌可通過誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡而逃避機體免疫系統(tǒng)識別，導(dǎo)致機體持續(xù)性感染。例如，當(dāng)巨噬細胞感染了表達Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，TTSS)的沙門菌，會因被誘導(dǎo)凋亡而無法將其加工處理的抗原呈遞給T細胞，但凋亡的巨噬細胞可作為沙門菌抗原的貯存庫。旁觀樹突細胞(dendritic cell，DC)通過攝取巨噬細胞凋亡物質(zhì)和菌體成分，以主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類和Ⅱ類分子的形式呈遞給T細胞。有趣的是，充當(dāng)旁觀抗原呈遞細胞似乎是DC的一個獨特功能，巨噬細胞只能攝取沙門菌誘導(dǎo)凋亡的細胞，而不能呈遞沙門菌抗原多肽[8]。而Guiney等認為，沙門菌誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡是一種特殊的毒力機制，可促進細菌在細胞間傳播[9]。凋亡的發(fā)生改變了細胞表面結(jié)構(gòu)，從而使受體介導(dǎo)的周圍巨噬細胞啟動對凋亡細胞的攝取，導(dǎo)致細菌在巨噬細胞間不斷擴散和感染。但適度誘導(dǎo)自噬可降低巨噬細胞凋亡率。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，自噬誘導(dǎo)劑西羅莫司〔雷帕霉素(rapamycin，RAPA)〕干預(yù)鼠傷寒沙門菌感染的小鼠巨噬細胞后，細胞自噬程度增強，細胞內(nèi)活菌數(shù)及其所致的巨噬細胞凋亡率明顯降低，提示調(diào)控細胞的自噬水平可降低宿主凋亡率，有利于增強機體抗感染能力[10]。此外，天冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific protease 1, caspase-1)的活化也可抑制沙門菌誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡，它可啟動細胞pyroptotic樣死亡，分泌促炎癥細胞因子IL-1β和IL-18, 通過招募和激活免疫細胞有效清除胞內(nèi)病原菌[11]。Pyroptotic是一種促進炎癥的細胞死亡程序，可應(yīng)對多種威脅，包括代謝應(yīng)激和細菌感染等，具有快速損壞細胞膜的完整性，導(dǎo)致細胞溶解并釋放促炎物質(zhì)的特點。

2 巨噬細胞作為沙門菌感染的宿主

沙門菌是一種兼性胞內(nèi)菌，侵入機體后主要寄居在單核-巨噬細胞中。沙門菌有毒株能侵襲小腸黏膜，經(jīng)回腸黏膜上M細胞(microfold cell)進入機體。其步驟是細菌黏附、細胞肌動蛋白重排和內(nèi)在化、細菌在吞噬泡內(nèi)繁殖釋放并再次被固有層中的巨噬細胞吞噬，如此循環(huán)往復(fù)。沙門菌的黏附和入侵由染色體中的侵襲素基因inv介導(dǎo)。

沙門菌導(dǎo)致的系統(tǒng)性感染依賴于在專職吞噬性細胞中存活的能力。這個過程是復(fù)雜的，包括改變細菌表面結(jié)構(gòu)以抵抗天然免疫的破壞，感知宿主的吞噬體環(huán)境，通過吞噬小體重塑而使宿主形成有利于細菌增殖的胞內(nèi)環(huán)境等。沙門菌對機體的毒力主要由2種TTSS介導(dǎo)，分別由SPI1和SPI2編碼，通過分泌蛋白或直接將毒力蛋白注入宿主細胞發(fā)揮致病作用。一旦細菌毒力蛋白進入胞內(nèi)，宿主細胞功能如細胞骨架、膜運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞因子基因表達等發(fā)生改變，以利于細菌在其中生存和增殖。盡管TTSS高度保守，但這2個系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白卻是獨一無二的。2種分泌系統(tǒng)都與細菌胞內(nèi)增殖有關(guān)，SPI1編碼的TTSS在細菌侵襲的初始階段發(fā)揮重要作用，可通過抑制巨噬細胞前炎癥因子表達[12]、誘導(dǎo)細胞骨架重排啟動大胞飲等作用，實現(xiàn)細菌侵襲，是多種動物和人類胃腸炎的重要致病因素[13]。SPI2編碼的TTSS及其效應(yīng)蛋白與沙門菌的系統(tǒng)感染有關(guān)，它可通過調(diào)節(jié)細菌在胞內(nèi)轉(zhuǎn)移、抑制吞噬體成熟和抵御宿主殺傷機制等方式，確保細菌在巨噬細胞內(nèi)生存和生長[14]。SPI2按基因結(jié)構(gòu)功能分成兩部分：一部分包含編碼雙組分調(diào)控系統(tǒng)的基因(ssrA和ssrB)、編碼TTSS的結(jié)構(gòu)成分基因ssa、效應(yīng)蛋白基因sse和伴侶蛋白基因ssc；另一部分包含編碼連四硫酸鹽還原酶的基因(ttrA、ttrB、ttrC)和雙組分調(diào)控系統(tǒng)基因(ttrR、ttrS)，與沙門菌的系統(tǒng)性感染無直接關(guān)系。研究表明，SsrB是沙門菌毒力基因的重要調(diào)節(jié)子，且SsrB能激活srfN基因，并直接控制其在細胞內(nèi)的感染[15]。SseA是SPI2依賴性轉(zhuǎn)移蛋白SifA和PipB所必需的，SifA與沙門菌在細胞質(zhì)內(nèi)的生存和復(fù)制密切相關(guān)。SpiC蛋白可干擾SCV在細胞內(nèi)的運動并阻止其與溶酶體融合，從而避開胞內(nèi)降解途徑。而spiC突變后再感染巨噬細胞時，細菌致病性及生存能力大大降低[16]。

此外，沙門菌能感知宿主的胞質(zhì)pH值，SPI2編碼的TTSS pH傳感器在中性環(huán)境中構(gòu)象發(fā)生改變，引起SsaM/SpiC/SsaL調(diào)控復(fù)合物降解，從而導(dǎo)致效應(yīng)蛋白易位，而酸性環(huán)境可防止復(fù)合物降解和效應(yīng)蛋白易位[17]。不僅如此，Lee等最新研究發(fā)現(xiàn)，宿主細胞的酸性環(huán)境還可引發(fā)胞質(zhì)ATP水平上升，而ATP含量變化激活沙門菌毒力基因，促進毒力蛋白表達，從而使沙門菌在宿主中得以存活[18]。

除致病島外，沙門菌的其他毒力基因?qū)ζ湓诰奘杉毎麅?nèi)的進一步生存也很重要，如攜帶spv基因的沙門菌不僅能抵抗和逃逸宿主的免疫防御，還能通過抑制自噬、促進凋亡而加重感染[19]。另一種調(diào)節(jié)基因tdcA突變后，會影響鞭毛和PhoP調(diào)節(jié)蛋白，使沙門菌在巨噬細胞內(nèi)存活數(shù)量下降[20]。脂質(zhì)A的變構(gòu)對于沙門菌在胞內(nèi)生存也至關(guān)重要。脂質(zhì)A鈍化酶LpxR可通過3′-O-脫酰作用對其進行修飾，從而降低其毒力，導(dǎo)致巨噬細胞內(nèi)生長的LpxR缺陷株數(shù)量明顯低于野生株。此外, 當(dāng)感染LpxR缺陷菌株時，它還可增強胞內(nèi)iNOS表達水平，說明脂質(zhì)A的3′-O-脫酰作用促進沙門菌在胞內(nèi)生長[21]。

3 結(jié)語

沙門菌作為一種兼性胞內(nèi)菌，在宿主體內(nèi)主要寄居在單核-巨噬細胞內(nèi)。在與宿主細胞長期相互作用的過程中，沙門菌已進化出一套精密的調(diào)控系統(tǒng)，不但具備抵抗溶酶體酶、抑制吞噬體-溶酶體融合、干擾ROI等逃避巨噬細胞殺傷的防御機制，而且可以巨噬細胞作為感染過程中的宿主，在細胞內(nèi)形成SCV。這不僅有利于細菌存活，還可有效逃避宿主的免疫應(yīng)答。因此，更深入了解巨噬細胞在沙門菌感染過程中的作用，將有助于探索沙門菌所致疾病的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，同時為預(yù)防和治療提供新的思路和對策。

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