周鶴峰 邵 敏 于立強(qiáng) 葛正龍 (遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物工程系，珠海519041)

阪崎腸桿菌(Enterobacter Sakazakii，ES)是一種周生鞭毛、革蘭氏陰性無芽胞桿菌，為腸道正常菌群中的一種，屬條件致病菌，新生兒特別是早產(chǎn)兒和免疫力低下的人容易導(dǎo)致腦膜炎、菌血癥和壞死性小腸結(jié)腸炎，幸存者也容易導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，死亡率高達(dá)20% ～50%［1］。近年來，阪崎腸桿菌感染事件國(guó)內(nèi)外相繼報(bào)道，已引起世界各國(guó)重視，其中較多的是嬰兒配方奶粉污染［2，3］。目前，ES檢測(cè)主要依賴傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)方法、分子生物學(xué)等檢測(cè)手段［4］，我國(guó)于2005年頒布了ES分離與計(jì)數(shù)檢驗(yàn)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但上述方法都存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作繁瑣等缺點(diǎn)，因此需要建立簡(jiǎn)便快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)手段。

國(guó)內(nèi)外尚未有關(guān)于制備阪崎腸桿菌單克隆抗體并應(yīng)用ELISA快速檢測(cè)試劑盒對(duì)ES進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道。本研究利用雜交瘤技術(shù)制備出能穩(wěn)定分泌抗ES的單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)的細(xì)胞株，為今后阪崎腸桿菌快速檢測(cè)試劑盒的研制奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 6周齡雌性BALB/c小鼠，體重18～20克，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)，中國(guó)武漢典型培養(yǎng)物保藏中心;阪崎腸桿菌，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;PEG1000、HAT、HT、TMB為 Sigma公司產(chǎn)品;DMEM、胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品;mAb亞類檢測(cè)試劑盒、羊抗小鼠IgG-HRP為武漢博士德公司產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔酶標(biāo)板Corning公司產(chǎn)品;其它試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2動(dòng)物免疫 阪崎腸桿菌離心后菌體加1%的甲醛滅活過夜，生理鹽水洗滌，用PBS稀釋至2×108CFU/ml作為免疫原。將菌體與弗氏完全佐劑等體積乳化混勻，按0.5 ml/只菌液量(1×108CFU/ml)腹腔免疫BALB/c小鼠，首次免疫后，于第14、28、42天分別加強(qiáng)免疫三次，間接ELISA法檢測(cè)血清效價(jià)，以未免疫小鼠血清作為陰性對(duì)照，以P/N≥2.1判定為陽(yáng)性，且最大抗血清稀釋倍數(shù)為該血清的效價(jià)，超過1∶10 000效價(jià)的BALB/c小鼠用于融合。融合前3天，取0.1 ml菌液尾靜脈注射加強(qiáng)免疫。

1.3細(xì)胞融合 取免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0，融合劑為PEG1000，按常規(guī)操作方法進(jìn)行。用未免疫小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，融合后的細(xì)胞在含HAT培養(yǎng)基、5%CO2培養(yǎng)箱中37℃選擇培養(yǎng)。

1.4陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克?。?］以滅活的菌體作為包被抗原，對(duì)細(xì)胞上清采用間接ELISA進(jìn)行檢測(cè)，篩選分泌陽(yáng)性抗體的雜交瘤細(xì)胞，以細(xì)胞融合的免疫小鼠血清作陽(yáng)性對(duì)照，以SP2/0的培養(yǎng)上清與正常BALB/c小鼠血清作為陰性對(duì)照。對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞株中OD450值高且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好的采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，亞克隆2～3次后對(duì)所有孔均為陽(yáng)性且能穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，液氮凍存。

1.5mAb腹水的制備 將8周齡BALB/c小鼠每只腹腔注射0.5 ml液體石蠟，7天后以1×106個(gè)/0.5 ml雜交瘤細(xì)胞注射BALB/c小鼠，待小鼠腹部明顯膨大，收集腹水，3 000 r/min離心5分鐘取上清，分裝，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6單克隆抗體特異性測(cè)定 用滅活的菌體作為抗原包被96孔酶標(biāo)板，封閉后，采用間接ELISA法，設(shè)置空白、陽(yáng)性對(duì)照，mAb分別和13種不同菌株進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)，交叉反應(yīng)越少，表明特異性越強(qiáng)。

1.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液和腹水效價(jià)測(cè)定 采用間接ELISA方法，以SP2/0的培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照，測(cè)定培養(yǎng)上清和腹水的抗體效價(jià)。

1.8單克隆抗體亞類鑒定 按照mAb亞類檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.9親和力的測(cè)定 以不同稀釋度的菌體抗原包被96孔板，間接ELISA法檢測(cè)相應(yīng)的OD值，以不同濃度mAb對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以其相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，繪制出測(cè)定曲線，以各曲線上部趨于平坦段的OD值為100%，查出其OD值為50%時(shí)的mAb濃度，根據(jù)公式計(jì)算每株mAb的親和力常數(shù)［6］。

1.10染色體分析 采用秋水仙素阻抑法對(duì)雜交瘤細(xì)胞的染色體進(jìn)行分析。將篩選得到的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，用秋水仙素處理，制備有絲分裂中期細(xì)胞，操作步驟按說明書進(jìn)行，Giemsa染色后觀察，每個(gè)細(xì)胞株觀察100個(gè)完整的中期核細(xì)胞，計(jì)數(shù)雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目。

1.11Western blot鑒定 按常規(guī)操作方法，將腹水使用飽和硫酸銨粗提蛋白，并適當(dāng)濃縮。菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以純化的mAb為一抗，羊抗小鼠IgG-HRP為二抗，進(jìn)行免疫印跡分析。

2 結(jié)果

圖1 雜交瘤細(xì)胞株Fig．1 Hybridoma cell lines

2.1雜交瘤細(xì)胞株的篩選和亞克隆 雜交瘤細(xì)胞株建立過程中共進(jìn)行2次融合，融合率在90%以上。細(xì)胞融合7～10天后，雜交瘤細(xì)胞克隆生長(zhǎng)至肉眼可見時(shí)，采用間接ELISA對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，篩選出效價(jià)高，細(xì)胞團(tuán)相對(duì)較少的細(xì)胞孔進(jìn)行三次以上亞克隆。細(xì)胞融合和亞克隆如圖1，細(xì)胞融合時(shí)，在HAT選擇培養(yǎng)下，一些未融合或自身融合的細(xì)胞死亡，背景雜亂，經(jīng)亞克隆培養(yǎng)后，可見背景相對(duì)清晰，單個(gè)克隆生長(zhǎng)。經(jīng)篩選和檢測(cè)獲得5株能穩(wěn)定分泌mAb的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為：1H7、2H9、2B12、4H4、5A5。

表1 單克隆抗體交叉反應(yīng)結(jié)果Tab．1 Cross reactivity result of mAb

表2 雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清和腹水抗體效價(jià)Tab．2 Antibody titer in supernatant and ascites

2.2單克隆抗體特異性鑒定 選擇阪崎腸桿菌同屬的陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌以及常見的食源性致病菌等共13種菌進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)，見表1，2H9能與陰溝腸桿菌出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，而與阪崎腸桿菌反應(yīng)陰性。4H4、5A5也分別與其他幾種菌體發(fā)生交叉反應(yīng)。結(jié)果表明，1H7、2B12具有良好的特異性。

2.3細(xì)胞培養(yǎng)上清液和腹水效價(jià)測(cè)定 分別收集陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水，按10倍梯度稀釋，間接ELISA方法檢測(cè)效價(jià)，以P/N值≥2.1時(shí)的最高稀釋倍數(shù)為此單抗的效價(jià)，結(jié)果如表2。

2.4單克隆抗體亞類鑒定及親和力的測(cè)定 采用抗體亞類試劑盒測(cè)定，1H7和2B12產(chǎn)生的單抗的抗體Ig亞類分別為IgG1和IgG2a。間接ELISA法測(cè)定mAb的相對(duì)親和常數(shù)分別為1.23×109L/mol和2.68×109L/mol，顯示制備的單抗與阪崎腸桿菌的親和力高。

2.5染色體分析 正常小鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)目為40條，小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0為62～68條，兩株雜交瘤細(xì)胞株染色體數(shù)目分別為104和106條，如圖2所示，表明雜交瘤細(xì)胞確為兩個(gè)親本細(xì)胞融合后產(chǎn)生。

圖2 雜交瘤細(xì)胞的染色體分析(Giemsa，×1 000)Fig．2 Chromosome number of hybridoma cells(Giemsa，×1 000)

圖3 單抗的Western blot分析Fig．3 Western blot analysis of mAb

2.6單克隆抗體的特異性檢測(cè) Western blot分析結(jié)果表明，兩株mAb能與阪崎腸桿菌的菌體總蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，說明其具有良好的特異性。

3 討論

阪崎腸桿菌是近幾年在乳制品中新發(fā)現(xiàn)的一種致病菌，已引起世界各國(guó)重視，但由于對(duì)其致病機(jī)理、免疫反應(yīng)、基因結(jié)構(gòu)等方面研究尚不清楚，因此，阪崎腸桿菌檢測(cè)方法僅為傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)方法、分子生物學(xué)等手段［7-9］，用膠體金檢測(cè)技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附法等免疫學(xué)檢測(cè)手段國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。我國(guó)于2005年在《奶粉中阪崎腸桿菌檢測(cè)方法》GB 4789.40-2010中規(guī)定了阪崎腸桿菌改進(jìn)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法、普通PCR方法和熒光PCR方法，近年一些研究學(xué)者相繼研究了 LAMP法［10］、TaqMan PCR［11］檢測(cè)法等改進(jìn)方法，但在單克隆抗體技術(shù)基礎(chǔ)上建立ELISA和膠體金檢測(cè)法目前尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)以1%的甲醛滅活的阪崎腸桿菌為免疫原對(duì)小鼠進(jìn)行免疫注射，其中滅活時(shí)間要大于16小時(shí)，低于16小時(shí)菌體尚未完全滅活，腹腔注射后對(duì)小鼠產(chǎn)生毒性，造成小鼠大量死亡，培養(yǎng)可見細(xì)菌增長(zhǎng)。經(jīng)過多次摸索細(xì)胞融合過程中免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞數(shù)目比、融合時(shí)間、操作手法等，使融合率提高至90%以上，孫慧慧等［12］曾報(bào)道使用PEG1000能實(shí)現(xiàn)較高融合率，本實(shí)驗(yàn)使用融合劑為PEG1000也驗(yàn)證這點(diǎn)，試驗(yàn)中也曾使用PEG4000，但融合率低于50%，由于PEG的相對(duì)分子質(zhì)量越大、體積分?jǐn)?shù)越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)、對(duì)細(xì)胞毒性越大［13］。

實(shí)驗(yàn)經(jīng)三次以上亞克隆，獲得5株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。阪崎腸桿菌為腸桿菌科腸桿菌屬的一種，其產(chǎn)生的抗體特異性決定單抗的應(yīng)用價(jià)值，因此，在對(duì)5株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)過程中，選擇同屬的陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，2H9、4H4能與陰溝腸桿菌發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，另選擇與阪崎腸桿菌同為常見的食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)，5A5與大腸桿菌O157：H7產(chǎn)生交叉反應(yīng);同時(shí)，抗體的穩(wěn)定性也是抗體分泌能力的關(guān)鍵因素，mAb2H9經(jīng)多次傳代進(jìn)行交叉反應(yīng)時(shí)與阪崎腸桿菌產(chǎn)生陰性反應(yīng)，證明其不能穩(wěn)定分泌抗體。最后，經(jīng)特異性篩選得到能穩(wěn)定分泌抗體的兩株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。

本實(shí)驗(yàn)所獲得的兩株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單抗分別為IgG1和IgG2a亞類且效價(jià)相對(duì)較高，經(jīng)Western blot鑒定，能與阪崎腸桿菌菌體蛋白特異性結(jié)合。該單克隆抗體的成功制備，為阪崎腸桿菌膠體金檢測(cè)試劑盒和ELISA快速檢測(cè)試劑盒的制備奠定了基礎(chǔ)。

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