宋紅普魏江磊吳中華韓振祥吳中平朱暉李歡歡

（1.上海中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，上海201203；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海201203；3.上海市曹楊街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海200310）

成人腦缺血造成的中樞神經(jīng)損傷后不能再生，是導致腦缺血遺留有各種后遺癥難以完全康復的重要原因。中樞神經(jīng)損傷后不能再生，除了與膠質(zhì)疤痕的空間阻礙作用和神經(jīng)生長因子的缺乏有關(guān)外，主要是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在著抑制神經(jīng)細胞生長的抑制因子［1］。本研究在前期發(fā)現(xiàn)生地黃及其主要組分梓醇對腦損傷具有保護作用的基礎(chǔ)上，進一步觀察生地黃免煎顆粒對神經(jīng)生長抑制因子Nogo-A蛋白表達的干預(yù)作用，探討其對缺血性腦損傷后的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 動物雄性健康SD大鼠120只分批購入，每批20只，清潔級，體質(zhì)量230～250 g，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，購自上海西普-必凱實驗動物有限公司。醫(yī)學實驗動物合格證號：SCXK（滬）2008-0016，大鼠購入后入IVC系統(tǒng)分籠飼養(yǎng)。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周左右，體質(zhì)量符合實驗要求之后準備手術(shù)造模。1.2造模方法 參照文獻采用改良的Longa法［2］制備大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，術(shù)前12 h禁食，自由進水。用10%水合氯醛按照0.35 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射麻醉。將麻醉后的大鼠仰臥位固定于鼠板上，頸部備皮，局部消毒之后行頸前部正中切口。分離右側(cè)頸部肌肉，依次暴露右側(cè)頸總、頸外和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總和頸外動脈，頸內(nèi)動脈掛線，用止血鉗夾住兩端線頭交叉放置于手術(shù)臺上，拉緊頸內(nèi)動脈掛線之后，用手術(shù)纖維剪于頸總動脈分叉下方1cm處剪一切口，將預(yù)先購得的頭端包被多聚賴氨酸的尼龍栓線向分叉端插入頸總動脈。松開拉住頸內(nèi)動脈栓線的止血鉗后，用手拉緊結(jié)扎頸總動脈的線頭，用眼科鑷將栓線插入頸內(nèi)動脈17～18 mm，直到有輕微阻力感為止。連同插入的尼龍栓線一起扎緊頸內(nèi)動脈掛線，剪去露在血管外的尼龍栓線，縫合創(chuàng)口及皮膚。再次消毒后每只大鼠腹腔分別注射4 mL生理鹽水，將大鼠置于放有清潔墊料的鼠籠中進行觀察。假手術(shù)組大鼠麻醉，暴露頸內(nèi)、外動脈分支后，僅結(jié)扎右側(cè)頸總、頸外與頸內(nèi)動脈，不插入尼龍栓線。

1.3 神經(jīng)功能評分及納入標準造模大鼠清醒后2 h進行神經(jīng)功能評分。神經(jīng)功能評分按照Longa的標準［2］，進行5級評分：0分為無神經(jīng)損傷癥狀；1分為不能完全伸展對側(cè)前爪；2分為向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分為向?qū)?cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。分值在1～3分者為造模成功，納入相應(yīng)組別，0分和4分者剔除。凡術(shù)中出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血、死亡、或者神經(jīng)評分不符合標準的均為模型制作失敗，不納入后續(xù)實驗，另隨機補充大鼠造模，保證每組實驗動物數(shù)量不變。

1.4 分組將造模成功并經(jīng)神經(jīng)功能評分篩選后的大鼠按照隨機數(shù)字表法進行分組，分為用藥組和模型組，另設(shè)假手術(shù)組。3組大鼠入組后又各自按照取材時間窗的不同分為3、7、14 d各3個亞組，記錄每組大鼠的編號，并加以跟蹤。各組大鼠在造模成功經(jīng)分組后，放回IVC系統(tǒng)中飼養(yǎng)。

1.5 藥物干預(yù)將生地免煎顆粒（購自上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，由三九醫(yī)藥集團股份有限公司生產(chǎn)，批號：10090425）溶于適量清潔自來水中，配制成生地黃含量為135 g/L的生地黃免煎顆粒溶液。用藥組大鼠分組稱體質(zhì)量后按照1 mL/100 g灌胃，上下午各1次。模型組和假手術(shù)組均同時給予相同體積的清潔自來水灌胃。各組大鼠均每3日稱體質(zhì)量1次，并依據(jù)各自體質(zhì)量調(diào)整大鼠的灌胃量，灌胃持續(xù)至大鼠處死取材之前。

1.6 標本采集各亞組大鼠分別在各自相應(yīng)時間點取材，取材時先將大鼠稱體質(zhì)量后0.4 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛深麻醉。將大鼠俯臥位放置于冰上，用剪刀從背部剪開項部皮膚及肌肉，剪短頸椎及脊髓，即可見到有血液從頸部斷開處流出，待頸部血液流盡后，用剪刀沿頂骨與枕骨交界處縱向剪開一小口，將剪刀尖部從剪開的縫隙中插入，注意不要觸及腦組織。向上外側(cè)用力分別撐開兩塊頂骨，暴露出兩側(cè)大腦半球，用鑷子小心撕開軟腦膜；用眼科剪沿腦干向下剪短脊髓，換眼科鑷捏住連在腦干上的脊髓段，將腦干及相連的脊髓拉出；將眼科剪輕插入大腦底部的空隙中，輕輕向上翹起大腦，剪斷顱底的三叉神經(jīng)和視神經(jīng)，將整個腦干與顱底結(jié)構(gòu)分離，最后剝離嗅腦并取出完整大腦。在放于碎冰上的培養(yǎng)皿中用手術(shù)刀片將距額極5 mm處切取2 mm厚的冠狀切片，取切片右側(cè)含皮質(zhì)及缺血半暗帶腦組織約50 mg左右，放入預(yù)先標記好的凍存管，轉(zhuǎn)移至-80℃的冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 檢測方法 （1）通過對造模前大鼠體質(zhì)量及造模結(jié)束后2 h神經(jīng)功能評分的觀察，了解用藥前各組大鼠的基線是否一致。（2）采用Western Blot法檢測腦組織中Nogo-A的表達量，一抗購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司，蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，二抗購自Jackson公司，內(nèi)參抗體購自上?？党缮锕こ逃邢薰?。Western Blot檢測方法 參照有關(guān)文獻和試劑盒說明進行，依照組織總蛋白提取、蛋白含量測定、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉與抗體孵育步驟進行，最后進行顯色反應(yīng)，并將膠片或顯色后的濾膜進行掃描或拍照，各組樣本經(jīng)過Western Blot檢測之后輸出顯色條帶。用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值，通過計算各樣品與GAPDH內(nèi)參蛋白的比值，得出Nogo-A蛋白的相對表達量，在此基礎(chǔ)上分析生地黃對MCAO造模后大鼠Nogo-A蛋白表達的干預(yù)效應(yīng)。

1.8 統(tǒng)計學處理采用IBM SPSS Statistics19軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析：基線一致性檢驗造模前進行，分別通過方差分析和Kruskal-WallisH檢驗分析不同組別大鼠體質(zhì)量和神經(jīng)學評分；通過方差分析檢驗造模后相同時間點不同組別之間Nogo-A蛋白相對表達量的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基線一致性檢驗見表1，表2。造模前各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。用藥組與模型組各時間點神經(jīng)學評分差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 造模前各組大鼠體質(zhì)量比較（g，s）

表1 造模前各組大鼠體質(zhì)量比較（g，s）

組別n3 d 7 d14 d用藥組6238.34±7.234模型組6235.50±17.108 237.00±14.353229.14±16.416 237.00±10.770226.50±5.875假手術(shù)組6231.50±20.345232.33±17.212231.67±14.706

表2 各組大鼠造模清醒后神經(jīng)學評分比較（n）

2.2 Nogo-A蛋白表達情況見表3。在造模后第3日和7 d時間點上，用藥組和模型組Nogo-A蛋白的表達與假手術(shù)組比較沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05），在第14日時間點上，與模型組比較，用藥組出現(xiàn)了顯著差異（P＜0.05）。

表3 各組大鼠Nogo-A蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠Nogo-A蛋白表達比較（±s）

與模型組同時段比較，*P＜0.05。

組別n3 d 7 d14 d用藥組60.727±0.422模型組61.968±2.087 1.281±0.3081.061±0.467*3.293±2.4062.010±0.581假手術(shù)組61.020±0.2601.195±0.8131.625±0.698

2.3 不同時間窗各組Nogo-A蛋白表達量的趨勢變化見圖1。用藥組和模型組Nogo-A蛋白的表達在造模后3～14 d均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且模型組的波動更加明顯一些。造模后第3日用藥組Nogo-A的表達水平較模型組為低。到造模后第7日時，用藥組和模型組Nogo-A蛋白的表達均有所升高，模型組升高的幅度更大一些。到了第14日，用藥組和模型組Nogo-A蛋白的表達均有下降，且用藥組明顯低于模型組，出現(xiàn)了統(tǒng)計學差異。造模后3～14 d，用藥組和假手術(shù)組Nogo-A蛋白的表達始終低于模型組，用藥組和假手術(shù)組相比水平相近或略低。

圖1 各組不同時間Nogo-A蛋白表達情況（±s）

3 討論

缺血性腦卒中屬中醫(yī)學“中風”范疇，該病起病急驟，發(fā)病迅速，而且難以徹底治愈，往往會留有各種不同程度的后遺癥。成人腦缺血后造成的中樞神經(jīng)損傷后不能再生，是造成腦缺血后遺留有各種后遺癥，難以完全康復的重要原因。研究表明，中樞神經(jīng)元不能再生，除了與膠質(zhì)疤痕的空間阻礙作用和神經(jīng)生長因子的缺乏之外，主要是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在著抑制神經(jīng)細胞生長的抑制因子，這些抑制因子主要包括硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPG）、NG2蛋白多糖、可溶性髓磷脂相關(guān)糖蛋白（MAG）、少突細胞髓磷脂糖蛋白（OMgp）和Nogo蛋白。其中，Nogo蛋白作為抑制中樞神經(jīng)再生最重要的物質(zhì)，越來越受到人們的重視。Nogo是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂中發(fā)現(xiàn)的一種抑制軸突生長的蛋白，因它對軸突生長具有抑制作用而被命名為Nogo，編碼Nogo蛋白的基因稱為Nogo基因。由于啟動子和剪切方式的不同，Nogo基因可以表達出3種mRNA的轉(zhuǎn)錄體，它們所編碼的蛋白質(zhì)分別稱為Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C［3-4］。其中，Nogo-A是Nogo蛋白中最主要的形式，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中由少突膠質(zhì)細胞和一些神經(jīng)元產(chǎn)生，存在于髓鞘的內(nèi)外環(huán)和少突膠質(zhì)細胞表面，是突觸再生抑制物［5］。Nogo是中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘磷脂中最重要的一種抑制軸突生長錐再生的蛋白質(zhì)，它可導致生長錐塌陷并抑制神經(jīng)元突起的延伸，也能夠被特異性抗體IN-1識別。實驗發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元生長過程中對Nogo基因的表達變化特別敏感，針對Nogo-A的抗體可抵消中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘在體外的抑制活性，表明Nogo蛋白具有強烈的中樞神經(jīng)生長抑制活性。

臨床實踐表明，中藥生地黃制劑對中風急性期腦損傷治療有可靠療效［6-7］，機理研究也顯示中藥生地黃及其主要組分梓醇有促使神經(jīng)元超極化，保護神經(jīng)元免受細胞毒性損傷［8-10］，減輕腦缺血后神經(jīng)元凋亡［11-12］等作用，顯示中藥生地黃及其組分梓醇對腦損傷具有保護作用。另外，梓醇還可上調(diào)腦缺血大鼠缺血周圍區(qū)皮質(zhì)生長相關(guān)蛋白43（GAP-43）的表達，促進軸突再生，加速神經(jīng)功能恢復［13］。但在生地黃對神經(jīng)生長抑制因子表達的干預(yù)效應(yīng)的研究方面，尚不多見。

從本實驗的結(jié)果 來看，經(jīng)MCAO造模造成腦缺血損傷之后，Nogo-A蛋白的表達出現(xiàn)升高趨勢，且呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第7日表達最為活躍；MCAO造模后經(jīng)生地黃免煎顆粒溶液灌胃干預(yù)以后，Nogo-A蛋白的表達水平均較模型組降低，且呈現(xiàn)先升高后又緩慢恢復的趨勢；相對于模型組，在造模后第14日，生地黃對Nogo-A蛋白的表達有明顯的下調(diào)作用。

由此可見，生地黃免煎顆粒能夠在一定程度上下調(diào)MCAO造模后引起的Nogo-A蛋白表達升高，有利于中樞神經(jīng)缺血后的神經(jīng)再生。

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