彭艷艷，孫麗娜，宋菁，金露，王小同

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 腦科、康復(fù)中心，浙江 溫州 325027）

低氧是一種常見的應(yīng)激，可引起機體結(jié)構(gòu)及功能的改變，其結(jié)果隨著低氧的程度、持續(xù)時間、機體反應(yīng)性的不同而異。低氧可廣泛影響機體的多個系統(tǒng)，包括神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸循環(huán)系統(tǒng)和肌肉骨骼系統(tǒng)等。骨骼肌作為人體最大的組織，為機體的活動提供動力。低氧可引起機體低氧應(yīng)激，從而導(dǎo)致骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能的變化[1-3]。線粒體（mitochondria）作為機體的“能量工廠”，是機體利用氧進(jìn)行呼吸功能和生成ATP的重要細(xì)胞器。低氧應(yīng)激可引起線粒體功能障礙[4]。同時線粒體也與細(xì)胞凋亡和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[5]。本實驗旨在通過利用低氧導(dǎo)致小鼠骨骼肌離體線粒體低氧的模型，探討低氧對小鼠骨骼肌離體線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）功能的影響。

1 材料和方法

1.1 動物與分組 SPF級C57BL/6雄性小鼠32只（由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），體質(zhì)量20～28 g，7～9周齡，按隨機數(shù)字表法分為低氧組和常氧組，每組16只。

1.2 試劑與儀器 線粒體分離試劑盒購自pierce公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天，小鼠CytC ELISA法檢測試劑盒、純化線粒體凍存液和GENMED純化線粒體膜通道孔比色法檢測試劑盒購于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、谷胱甘肽（GSH）測試盒、微量丙二醛（MDA）測定試劑盒均購自南京建成科技有限公司，連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）為國產(chǎn)分析純；TECNAI10透射電子顯微鏡（PHILIPS公司），ALLEGRA-64R臺式高速冷凍離心機（美國BECKMAN公司），熒光分光光度計，MD連續(xù)波長酶標(biāo)儀（美國），AVL-COMPACT3型血氣分析儀（瑞士AVL公司）。

1.3 小鼠骨骼肌離體線粒體低氧模型的建立 提取線粒體后，低氧組將0.5 mL的線粒體懸液加入2 mL的密閉容器中，保持37 ℃并向內(nèi)通入100%氮氣及氧清除劑Na2S2O40.5 mmol·L-1致PO2測不出來，保持30 min。常氧組：線粒體懸液置于空氣中，其他條件同低氧組。

1.4 取材和檢測方法

1.4.1 小鼠骨骼肌線粒體的提?。盒∈笾苯佑妙i椎脫臼法處死，分離后肢股四頭肌，立即放入4 ℃預(yù)冷的PBS液沖洗2次，仔細(xì)去除PBS，將組織剪碎后加800μL PBS液，玻璃勻漿器冰上研磨后1000×g，4 ℃離心3 min，棄上清液，沉淀物加入800μL LBSA/A液，漩渦振蕩5 s（中速），冰上孵育最長2 min，再加入10μL B液，漩渦振蕩5 s（高速），冰上孵育5 min，并且每分鐘高速振蕩1次，后再加入800μL C液，倒置混勻，不可振蕩。700×g，4 ℃離心10 min后棄沉淀將上清轉(zhuǎn)移到2 mL管中，12000×g，4 ℃離心15 min，棄上清液，保留沉淀，在沉淀中加入500μL Wash Buffer，12000×g，4 ℃離心5 min后棄上清液，得到線粒體沉淀，在沉淀中加入200μL線粒體凍存液制成線粒體懸液。整個提取過程均在冰浴中（0～4 ℃）進(jìn)行，提取的線粒體冰上保存，當(dāng)天檢測指標(biāo)。

1.4.2 線粒體蛋白含量測定：采用BCA法。

1.4.3 骨骼肌線粒體膜電位測定：取線粒體懸液50μL加入現(xiàn)配的1 mL JC-1染液中，再加入2 mL蒸餾水，在激發(fā)波485 nm，散發(fā)波590 nm條件下用熒光分光光度計測定反映線粒體膜電位的相對熒光單位（RFU)。JC-1染液的配制參照上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒說明書操作。

1.4.4 MPTP開放狀態(tài)檢測：取線粒體懸液70μL加入到96孔板的對應(yīng)孔里，再加入170μL GENMED緩沖液（Reagent A)，混勻，即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀在波長540 nm條件下讀數(shù)，觀察MPTP開放狀態(tài)。

1.4.5 線粒體CytC測定：造模后的線粒體懸液于10000×g，4 ℃，離心10 min，取上清檢測CytC具體操作見說明書。

1.4.6 SOD、GSH和MDA測定：根據(jù)蛋白定量結(jié)果取線粒體懸液適量，再用線粒體緩沖液補足至500 μL，玻璃勻漿器冰上研磨5 min破膜，10000×g 4 ℃，離心10 min， 取上清檢測 SOD活性、GSH和MDA含量（具體按照南京建成提供的說明書操作）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理方法 正態(tài)性檢驗采用shapirowilk檢驗，方差齊性采用levene檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌MPTP開放狀態(tài)測定 以待測樣本的吸光值比值來代表離體線粒體MPTP的開放狀態(tài)，吸光值越低，表示MPTP開放增加。與常氧組比較，低氧組骨骼肌線粒體的吸光值比值明顯降低，提示低氧組MPTP開放增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）見表1。

表1 線粒體膜通道孔開放、線粒體膜電位和CytC含量

2.2 線粒體膜電位測定 與常氧組相比，熒光分光光度計的定量測量結(jié)果提示低氧組線粒體膜電位明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1 2.3 線粒體釋放的CytC含量測定 與常氧組相比低氧組線粒體釋放的CytC含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表1。

2.4 線粒體SOD活性和GSH、MDA含量測定 和常氧組相比，低氧組的線粒體SOD活性明顯降低，GSH含量明顯降低，MDA含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表2。

表2 SOD活性和GSH、MDA含量

3 討論

線粒體在細(xì)胞的正常生命活動和細(xì)胞死亡的過程中發(fā)揮著重要的作用，大多數(shù)的真核生物利用線粒體通過氧化磷酸化作用合成ATP，為機體各種生命活動提供能量。線粒體的正常功能與線粒體膜電位（mitochondrial transmembrane potential，Δ Ψm）有關(guān)，線粒體內(nèi)外膜物質(zhì)平衡依賴于線粒體的膜電位正常[6]。線粒體膜通透性（permeability transition，PT）改變可以引起ΔΨm的下降，而PT由MPTP所調(diào)控。MPTP是一種跨膜蛋白孔道，是由位于線粒體內(nèi)膜和外膜上的多種蛋白組成的蛋白復(fù)合體。正常生理條件下，MPTP處于關(guān)閉狀態(tài)，線粒體內(nèi)膜除對一些選擇性的代謝底物和離子外，對其他物質(zhì)都沒有通透性。然而在低氧、缺血再灌注損傷、鈣超載等應(yīng)激條件下，MPTP開放，通透性增加，內(nèi)膜外的小分子物質(zhì)大量進(jìn)入內(nèi)膜，使基質(zhì)內(nèi)的滲透壓增大，又進(jìn)一步促進(jìn)小分子物質(zhì)不斷進(jìn)入內(nèi)膜，導(dǎo)致線粒體的腫脹，外膜破裂，從而釋放存在于內(nèi)外膜間的CytC和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）等凋亡蛋白，導(dǎo)致線粒體損傷和功能障礙[7-9]。Ca2+、氧化應(yīng)激、無極磷酸鹽、pH值增大等可以促進(jìn)MPTP的開放，而Mg2+、環(huán)孢素A（CsA）、pH值降低、米帕林、狄布卡因可以抑制MPTP的開放[10]。MPTP開放的結(jié)果取決于開放的程度和時間，嚴(yán)重者可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死[11]。

我們的先期實驗發(fā)現(xiàn)慢性低氧高二氧化碳血癥可以導(dǎo)致骨骼肌纖維萎縮，肌細(xì)胞線粒體增多并伴有線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的明顯損害[12]，凋亡可能部分參與了慢性低氧高二氧化碳引起的這種骨骼肌萎縮[13]。同時，我們還發(fā)現(xiàn)慢性低氧高二氧化碳條件下小鼠大腦線粒體能量生成障礙、COXI和III活性受到抑制，SOD活性、GSH含量顯著降低，推測線粒體的功能障礙可能和氧化應(yīng)激有關(guān)[14]。本實驗采用離體的線粒體低氧模型，可以直接定位觀察低氧對線粒體功能的損害。實驗結(jié)果為低氧組MPTP的開放增加，線粒體膜電位下降明顯，CytC釋放增多，SOD活性、GSH含量顯著降低，MDA含量明顯升高。以上結(jié)果在某種程度上支持我們先期的實驗結(jié)論。

線粒體是產(chǎn)生內(nèi)源性自由基的主要場所，同時也是自由基攻擊的靶部位[15]。本實驗中MPTP開放和膜電位的下降，可能與自由基引起的損傷有關(guān)。與常氧組相比，低氧組小鼠骨骼肌離體線粒體中SOD活性、GSH含量顯著降低，MDA含量明顯升高。SOD和GSH是機體兩種主要的自由基清除酶，其活性可以反映機體清除氧自由基的能力。GSH還是重要的保護(hù)因子，可以保護(hù)生物膜和生物大分子免受自由基的攻擊。

氧自由基清除不足可以抑制SOD的活性，同時氧自由基還可以作用于生物膜中的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）引起脂質(zhì)過氧化，并形成脂質(zhì)過氧化物如MDA。線粒體產(chǎn)生ROS越多，對膜脂質(zhì)攻擊作用越強，生成的MDA也越多。MDA含量可以反映脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映了細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。在本實驗中，低氧組的小鼠骨骼肌離體線粒體內(nèi)MDA含量明顯升高，表明低氧后線粒體內(nèi)氧自由基生成增加和組織損傷。因此，SOD活性、GSH含量下降，MDA含量增加，與氧化應(yīng)激有關(guān)。這可能是MPTP開放增加，線粒體膜電位下降， CytC釋放增加的重要原因。

此外，從理論上推測，MPTP開放，線粒體膜電位降低，CytC釋放增加等還可誘導(dǎo)凋亡，從細(xì)胞凋亡途徑影響線粒體。

綜上所述，本實驗從線粒體損傷角度解釋了低氧所致機體損害的可能病理生理機制。低氧可通過增加小鼠肌肉離體線粒體的MPTP開放，下調(diào)膜電位，釋放CytC，抑制SOD活性、降低GSH含量，升高M(jìn)DA含量，即通過增強脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和細(xì)胞凋亡途徑等多種機制導(dǎo)致線粒體損傷。

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