饒品歡，石朝暉，李文姝，呂艷，陳向敏，朱珊麗，張麗芳

（1.溫州醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室、分子病毒與免疫研究所，浙江 溫州 325035；2.平頂山市疾病預(yù)防控制中心 檢驗(yàn)科，河南 平頂山 467000）

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是一類通過黏膜感染，嚴(yán)格胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物，不僅是發(fā)展中國(guó)家感染性致盲的主要原因[1]，也是引起人類性傳播疾病的一種重要病原體。Ct持續(xù)性感染可導(dǎo)致女性慢性盆腔炎、不孕和異位妊娠等嚴(yán)重并發(fā)癥，同時(shí)Ct生殖道感染還能提高HIV和高危型HPV傳播的概率[2-4]。

抗生素對(duì)Ct生殖道感染具有很好的療效，但不能改善已經(jīng)發(fā)生的病變，同時(shí)由于無癥狀性衣原體感染普遍存在，給預(yù)防Ct的感染和并發(fā)癥的發(fā)生帶來很大困難。因此研制安全有效的疫苗是控制泌尿生殖道Ct感染的最好方法之一。Ct主要外膜蛋白（major outer membrane protein，MOMP）占Ct外膜蛋白的60%，是引起宿主免疫反應(yīng)的主要靶抗原。抗原是誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)的決定因素，而免疫劑量也影響免疫反應(yīng)發(fā)生的強(qiáng)弱，由于表位是免疫反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，我們前期工作構(gòu)建了含T、B細(xì)胞表位的重組多表位Ct MOMP168[5]，本研究則探討通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建成功的Ct多表位重組真核表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168）以DNA免疫方式誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答的最適免疫劑量，為進(jìn)一步研究pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168體內(nèi)免疫學(xué)效應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）系Invitrogen公司產(chǎn)品；質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168和Ct E血清型由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建或保存；限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI均購(gòu)自上海晶美公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提純化試劑盒（Endofree Plasmid Maxi Kit）購(gòu)自上海吉泰新繹生物技術(shù)有限公司（QIAGEN公司產(chǎn)品）；HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗鼠IgA均購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司（KPL公司產(chǎn)品）；DL2 000TMDNA Marker和DL10 000TMDNA Marker均為TaKaRa公司產(chǎn)品；核酸蛋白分析儀（美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品）；Elx 800型全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（美國(guó)BioTek公司產(chǎn)品）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡BALB/c雌性小鼠[SCXK（滬）2007-0005]，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，并飼養(yǎng)于溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)飼養(yǎng)室。

1.3 pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168的制備 質(zhì)粒的構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)[5]。構(gòu)建成功的pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168重組真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α菌株（Stratagene產(chǎn)品），利用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提純化試劑盒抽提與純化，通過HindIII、XhoI雙酶切和PCR鑒定（擴(kuò)增Ct MOMP168多表位特異性引物：上游引物為5’-GTCGACAAGCTTATGGGCGATAA TGAAAACCAGAG-3’，下游引物為5’-GTGGTGCTCGAG TTAGACTCCAATATATGG-3’），引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。重組質(zhì)粒鑒定正確后，于核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定質(zhì)粒濃度。

1.4 動(dòng)物免疫 BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為4組，每組9只。根據(jù)文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)三個(gè)免疫劑量組，即50、100和150μg劑量組，同時(shí)設(shè)PBS對(duì)照組。免疫前24 h小鼠腿部肌肉注射0.5%的利多卡因100μL松弛肌肉，鑒定正確的pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168重組質(zhì)粒溶解于PBS緩沖液中，分別以上述3個(gè)免疫劑量于小鼠股四頭肌注射免疫，間隔2周，共免疫3次。PBS對(duì)照組注射同體積的PBS。于免疫后0、2、4、6、8周分別尾靜脈采血，分離血清-20 ℃凍存?zhèn)溆?；并于免?、1、3、5、7周取小鼠陰道沖洗液，100～200μL/只，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清特異性抗體IgG以本實(shí)驗(yàn)室制備的原核表達(dá)Ct MOMP168多表位重組純化蛋白（制備方法參照文獻(xiàn)[5]）作為檢測(cè)抗原，用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）包被96孔酶標(biāo)板，每孔包被檢測(cè)抗原100μL（50μg/mL），4 ℃過夜，PBS-Tween 20洗滌后，加入100μL PBSTween20-BSA（pH 7.4），37 ℃封閉2 h，洗滌后，每孔加入100μL各組小鼠血清（1:100稀釋），37℃ 1 h，洗滌后，每孔加入HRP-羊抗鼠IgG（1:2000稀釋）100μL，37 ℃ 1 h，洗滌后以鄰苯二胺（OPD）-H2O2室溫避光顯色15 min，加終止液（2 mol/L H2SO4）后，于酶標(biāo)分析儀490 nm處讀取各孔A490值。

1.6 間接ELISA法檢測(cè)小鼠陰道沖洗液中特異性抗體sIgA 具體操作同上，以純化的原核表達(dá)Ct MOMP168多表位重組蛋白為檢測(cè)抗原，一抗為小鼠陰道沖洗液（100μL/孔），二抗為HRP-羊抗鼠IgA（1:2000稀釋），其余同上。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168的抽提和鑒定 質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168抽提純化鑒定后結(jié)果見圖1。重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168（泳道2）較空質(zhì)粒pcDNA3.1（+）對(duì)照（泳道1）有抬高，酶切出現(xiàn)168 bp目的片段和載體片段（泳道3），PCR擴(kuò)增后同樣出現(xiàn)168 bp的目的條帶（泳道4），與預(yù)期目的基因片段大小一致，進(jìn)一步測(cè)序后序列正確。核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定質(zhì)粒濃度為1.2 mg/mL。

圖1 質(zhì)粒鑒定圖

2.2 免疫小鼠血清中Ct MOMP168特異性抗體IgG的檢測(cè) 不同免疫劑量組小鼠血清中針對(duì)Ct MOMP168特異性抗體IgG的檢測(cè)結(jié)果見圖2。3個(gè)不同免疫劑量組，血清中特異性抗體IgG生成量于免疫第4周后均開始隨免疫時(shí)間延長(zhǎng)而逐步增加，3組不同免疫劑量組于4、6、8周抗體產(chǎn)生水平比較PBS對(duì)照組均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中150μg劑量組抗體IgG的產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)顯著，于4周（0.572±0.052）、6周（1.282±0.051）、8周（1.559±0.060)分別比較其他劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），顯示了質(zhì)粒DNA免疫時(shí)抗體的產(chǎn)生具有明顯的劑量依賴關(guān)系。

圖2 免疫小鼠血清中Ct MOMP168特異性抗體IgG的檢測(cè)

2.3 免疫小鼠陰道分泌物中Ct MOMP168特異性抗體SIgA的檢測(cè) 不同免疫劑量組小鼠陰道分泌物中Ct MOMP168特異性分泌抗體SIgA的檢測(cè)結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，特異性抗體SIgA生成迅速，而且顯示出劑量依賴性。免疫開始后1周，150μg劑量組SIgA的生成比較PBS對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而100、50μg劑量組比較PBS對(duì)照組差異均不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。150μg劑量組免疫后1周、3周比較其他劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），5周時(shí)SIgA的生成達(dá)到峰值，7周后各免疫劑量組SIgA均開始下降，但150μg劑量組SIgA生成仍高于其他劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而50μg劑量組比較PBS對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖3 免疫小鼠陰道沖洗物中Ct MOMP168特異性抗體SIgA的檢測(cè)

3 討論

DNA免疫最大的優(yōu)點(diǎn)就在于其進(jìn)入體內(nèi)后，疫苗抗原可以在靶細(xì)胞內(nèi)以天然的方式被合成、加工并提呈給免疫系統(tǒng)，從而激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)疫苗基因產(chǎn)物特異性的CTL及抗體反應(yīng)[7]。刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)的方式與自然感染病原體的方式非常接近，這一特點(diǎn)對(duì)于構(gòu)象型抗原表位引發(fā)保護(hù)性免疫尤為重要，因?yàn)槟壳爸亟M技術(shù)在體外合成的蛋白質(zhì)抗原常造成抗原表位的改變或丟失[8]。

由于Ct屬于胞內(nèi)寄生菌，目前臨床上的治療方法很難有效徹底清除體內(nèi)的病原體[9]。Th1型免疫反應(yīng)被認(rèn)為是清除Ct生殖道感染的主要機(jī)制，盡管血清抗體IgG、IgA、IgE等可提供一定的保護(hù)作用，且在Ct再次感染中發(fā)揮重要作用，但多數(shù)情況下無法阻止感染的擴(kuò)散和疾病惡化[10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)生殖道局部的分泌性抗體SlgA在防御和清除Ct感染中更具有明顯作用[11]，可阻斷Ct對(duì)黏膜上皮細(xì)胞的黏附，從而阻斷其對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)一步的感染，還可通過抗體介導(dǎo)的調(diào)理作用增強(qiáng)巨噬細(xì)胞殺傷Ct的活性，或通過抗體依賴的細(xì)胞毒作用清除細(xì)胞內(nèi)感染[12]。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了3個(gè)常用免疫劑量，從Ct特異性抗體IgG及分泌性抗體SIgA的動(dòng)態(tài)發(fā)生過程來確定最有效的免疫劑量。結(jié)果顯示，3個(gè)不同免疫劑量組小鼠血清中Ct MOMP168特異性抗體IgG產(chǎn)生水平均隨免疫時(shí)間延長(zhǎng)而升高，其中150μg劑量組免疫開始第4周后，特異性抗體IgG生成量比較其他劑量組顯著升高。免疫小鼠陰道分泌物中SIgA的產(chǎn)生較快，免疫開始1周后150μg劑量組SIgA的生成水平顯著高于PBS對(duì)照組，且高于100μg劑量組。因此，pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168免疫后，小鼠特異性抗體IgG和陰道沖洗液中分泌性抗體sIgA的產(chǎn)生水平均表現(xiàn)出顯著的劑量依賴性，原因可能是高劑量免疫造成質(zhì)粒吸收優(yōu)勢(shì)。最終，本實(shí)驗(yàn)為Ct MOMP168多表位重組真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠確立了150μg的免疫劑量，為繼續(xù)研究Ct MOMP168多表位質(zhì)粒載體疫苗的免疫保護(hù)效應(yīng)提供了有效可行的免疫參考劑量。

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